Форма помогает оценить сбалансированность PCR реакции и необходимое число циклов. Оценка довольно примитивная, так что полностью на неё полагаться опасно.
Параметры по умолчанию соответствуют амплификации 2kbp фрагмента из 0.5µg человеческой DNA. Предполагается, что:
условия реакции близки к нормальным, так что не приходится беспокоиться о самой возможности проведения PCR (слишком высокая концентрация полимеразы чревата амплификацией грязи, слишком много праймеров - образованием праймер-димеров);
A, T и G, C входят в PCR продукт поровну;
праймеры не образуют праймер-димеров;
Taq полимераза не теряет активность в ходе реакции.
Оценка проводится следующим образом. Обозначим:
длина PCR продукта = L [kbp];
концентрация каждого из dNTP's = с [mM];
количество каждого из праймеров = q [pmol];
количество Taq полимеразы = a [u];
объём реакции = V [µl];
время элонгации = t [min];
количество матрицы = mo;
Тогда:
количество синтезированного PCR продукта можно оценить, как минимум из двух:
количество при полном расходе нуклеотидов:
mn = 4[нуклеотида] x с[mmol/l] 324.5[g/mol] x V[µl] = 1300сV [ng]
количество при полном расходе праймеров:
mp = q[pmol] x 2[цепи] 324.5[g/mol] x L[kbp] = 650qL [ng]
максимальное количество PCR продукта, которое может быть синтезировано за один цикл, зависит от двух факторов:
скорости движения Taq полимеразы по матрице: 2-4[kbp/min];
активности полимеразы (1 u активности - количество фермента, которое включает 10nmol всех четырёх dNTP’s за 30 min при 72oC).
mcycle = 10[nmol] x 324.5[g/mol] x a [u] t[min] / 30[min] = 108at [ng]
количество циклов, которое требуется для синтеза "mmax" PCR-продукта:
mmax = 2n x mo => n = ln(mmax/mo)/ln2
связь молярных и весовых количеств:
m[µg] = 649[g/mol] x q[µmol] x L[kbp] x 1000