занять робот на те дни, когда вы собираетесь проводить споттинг;
убедиться, что имеется достаточно мембран, Gel-blotting-papier GB004, 20хSSC, 10M NaOH, 30%EtOH, 96%EtOH, нарезать Whatman 3MM по размеру мембран;
перенести PCR продукты из PCR-плашек в PC-плашки со щелочью (хранить несколько дней в холодной комнате);
Подготовка робота
включить компьютер (с клавиатуры) "MPI Spotting robot LabVIEW", Matthias/spot;
включить главный выключатель (зеленая кнопка в левой нижней части);
включить "Linear drivers" (черный переключатель левее и ниже);
подождать пока установятся драйверы ~ 10';
если Вы не предыдущий пользователь робота, проведите тестирование установок робота:
* вставить gadget и поместить в stack несколько пустых плашек;
* выбрать из главного меню "Configure hardware";
* из Maintenance menu выбрать "Function run page";
* проверить, что при работе с плашками не возникает никаких проблем: "Take plate" и затем "Put plate" в различные позиции stack ("plate number");
* оставить последнюю плашку в держателе, вернуться (выбрав "ОК") в Maintenance menu;
* выбрать "Hardware config. Page";
* выбрать №3 в маленьком окне рядом с красным окном "Config. array";
* нажать "Kill" (отключается управление роботом) и аккуратно переместить робот так, чтобы иглы gadget оказались точно в центре и дна microtiter plate.
* сравнить значение "Z-position" co значением в окне "Misc. 1"; реальное значение должно быть на 1 mm больше установленного (Внимание!!! Все расстояния указаны в микронах!)
* положить по одному листу Schleicher&Schuell GB004 и на позицию "filter 3". переместить робот так, чтобы иглы gadget едва касались Watman 3MM;
* выбрать №9 в маленьком окне;
* сравнить значение "Z-position" co значением в окне; реальное значение должно быть на 1-2 mm больше установленного (Внимание!!! Все расстояния указаны в микронах!);
* в случае несовпадения нужно проконсультироваться с инженером.
Калибровка положения фильтров
оргстеклянные блоки вымыть и высушить;
подписать те, которые предполагается использовать; уложить GB004, 3MM и писчую бумагу (вместо мембран);
провести ink-test spotting (gap = 1000µm) 1x перенос по угловым полям фильтров;
отметить на оргстеклянных блоках требуемое положение фильтров;
можно проводить реальный споттинг.
Перенос
менять 30% EtOH в щетке через каждую вторую плашку;
по нашему мнению полтора цикла отмывки на щётке недостаточно для хорошей отмывки игл, поэтому мы дополнительно перед каждой чашкой промакиваем иглы мягким поролоном (вручную в перчатках).
При запуске/перезапуске работа gadget-держатель нужно поместить в ~30 cm от "Home position" ("Home position" - левый верхний дальний угол робота.
Воздушный вентиль - нижний передний угол левого края робота. Следует использовать, если при остановке робот зажал плашку.
Градиент плотности споттинга в пределах поля по вертикали или горизонтали означает проблемы с установкой положения gadget при обмакивании в плашку. Проблема может быть решена поправкой ~в 0.1 mm (как это можно объяснить логически я не знаю).
Плашки следует помещать в робот понемногу (2 плашки перед той, которая в данный момент в работе), иначе они подсохнут по краям за время споттинга. Остальное время плашки должны находиться в холодной комнате.
Чтобы иметь представление о необходимом для spotting времени: на "Amazon" для 10-кратного переноса одной плашки на 6х6 полей требуется ~27 минут.
Есть два альтернативных варианта проведения spotting:
* из PCR смеси на влажные (в 0.4M NaOH) мембраны,
* на сухие мембраны из PCR смеси к которой добавлен NaOH до 0.5M.
Оба способа имеют как преимущества, так и недостатки.
При переносе на влажные фильтры:
пятна получаются заметно большего размера, чем при переносе на сухие (не рекомендуется плотности выше, чем 4х4),
при spotting большого количества плашек мембраны могут подсыхать, равномерность подсыхания на разных мембранах практически не контролируется;
При переносе на сухие фильтры:
требуется дополнительная операция - добавление к PCR-смеси NaOH,
говорят, что присутствие щелочи портит PCR-продукты (возможно, что это зависит от присутствия бетаина), поэтому принято после её добавления быстро (в течение ~недели отспотить все фильтры);
Мы считаем, что преимущества споттинга на сухие фильтры сильно перевешивают его недостатки.
Установочные значения для нашего споттинга:
Dryer position
X
413555
Directly above dryer
Y
747765
Z
172500
MISC1
119000
Retreat position
MISC2
5000
Time in dryer
Home
X
50000
Y
50000
Z
50000
Ink position
X
1127890
Above the plate
Y
769325
Z
100000
MISC1
134300
Dip Z pozition
MISC2
100
(ms) in plate
Plate stack
X
1174500
Plate 1 position
Y
538900
Z
-5800
MISC1
1033515
Offset when grabber has released plate in plate stack (careful setup!)