MolBiol.ru > Методы > Кл. культуры > Основные приёмы работы | |
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|
Базовые методы
Снятие клеток с культуральных сосудов Замороженные клетки достаточно хрупкие (плохо переносят пипетирование) и требуют аккуратного обращения. Клетки размораживают быстро и помещают сразу в полную ростовую среду. Если клетки чувствительны к криоконсервантам (ДМСО, глицерин), их центрифугируют, чтобы удалить криоконсервант, и затем сажают в полной среде. а. Метод с отмывкой от криоконсеванта Дополнение от Павла Гулак (ИБГ РАН): Если клетки очень чувствительны к ДМСО, то рзмораживать их можно до нулевой температуры (последние минуты - в руке, для удобства наблюдения за таянием льдышки вверху пробирки) и центрифугировать холодную взвесь клеток и даже в охлажденной центрифуге. б. Метод непосредственной посадки Количество клеток в суспензии можно просчитать в камере Горяева. Как правило, одновременно определяют жизнеспособность клеток методом исключения красителя (трипановый синий, эритрозин В, нигрозин). Живые клетки не проницаемы для красителей, а мертвые клетки проницаемы и окрашиваются. Для определения количества живых клеток аликвоту суспензии (~40µl) смешивают с равным количеством 0.4% (w/v) раствора красителя в HBSS. Несколько микролитров смеси вносится под покровное стекло камеры Горяева. Количество "квадратов", в которых просчитываются клетки зависит от плотности клеточной культуры и от той точности, которая необходима (лучше просчитывать не менее 40-50 клеток). Камера Горяева. Технические данные. Для клеток неразведённой суспензии: либо (более предпочтительно) в сухом льду, замороженными; либо при комнатной температуре: клетки выращивают до 60-80% монослоя, удаляют старую среду, культуральный флакон заливают полной средой доверху и плотно закручивают крышкой. При таком способе клетки можно сохранить живыми в течение 2 суток. NB! На наш взгляд, лучше предварительно "кондиционировать" новую среду в CO2-инкубаторе. |
Смотри также: /ссылки на сетевые ресурсы/
|
Растворы Все среды и растворы для эукариотических клеток готовятся на воде mQ или эквивалентного качества. (хранить основной сток при -20 оС, рабочее количество (на месяц работы) - при +4оС); Плохо переносит замораживание-оттаивание, т.к. это вызывает денатурацию белков. Если требуется тепловая инактивация (для инактивации системы комплемента и предотвращения иммунологической реакции против культивируемых клеток) перед первым использованием расплавить и прогреть при 56оС 30' - 1h (вначале прогрева перемешать несколько раз). Подписать, что сыворотка heat inactivated (HI), оставить рабочее количество на +4оС, остальное разаликвотить, быстро заморозить (жидкий азот, сухой лёд) и хранить при -20оС. (хранить сток при -20оС, рабочее количество при +4оС). (хранить при -20оС) Плохо переносят замораживание-оттаивание. Перед первым использованием расплавить, разаликвотить, по возможности быстро заморозить. (хранить при +4оС). Обычно приготовление из сухих сред обходится гораздо дешевле, чем покупка готовых растворов. Полная (с сывороткой) среда готовится не более, чем на 1 месяц работы; не надо пытаться достигнуть "абсолютной точности" при добавлении сыворотки, той точности, которая обеспечивает градуированная банка, вполне достаточно. Разливать среду по матрасам можно "через" 50ml пробирку (и при разливе никогда не опираться о край "грязных" матрасов).
Комментарии п.1. п.4. п.5.
п.11. Дополнения и комментарии людей знающих Вадим ШаровКак мыть культуральный пластик. Детергентом или хромпиком. Но после хромпика тщательно отмывать. Стерилизовать пластик только ультрофиолетом непрактично - желтеет и портиться, да и не слишком стерильно. Лучше 70% спиртом и чуть чуть на ультрофиолет (30 минут). А лучше (если есть) кобальтовой пушкой. Как чистить CO2 инкубатор при заростах. Все зависит от СО2 датчика. Можно ли модифицировать поверхнось дешёвого пластика, чтобы использовать его для клеточных культур. Вообще полчаса в жестком хромпике и даже старые иммунологические платы связывают белки как новые, а клетки растут как звери. Только надо много раз полоскать после хромпика. Теперь о заморозке. Лучше чем замораживание в сыворотке (90%) DMSO (10%) не знаю. С фибробластами, даже первичными после такого замораживания не надо мучаться с откруткой от криопротектора. Дополнения, комментарии, вопросы _Ella_ /11.01.2006 02:08/
Довожу до сведения всех присутствующих, что ежели кто, желая снять эукариотические клетки с чашки Петри раствором Версена-трипсина, зальет их вместо этого содержимым стоящей рядом баночки с этанолом, пусть не беспокоится. Ничего страшного, не загнутся, спиртное в малых дозах полезно в любых количествах (спирт, правда, после запоздалого раскаяния лучше слить). Оно конечно не удивляет. Мы-то тоже вроде пока живы. Olena Bilyk /22.02.2006 23:06/
Дорогие коллеги! Посоветуйте как заморозить клетки асцитической жидкости, взятые непосредственно у онкологических больных. Я первый раз с этим работаю, требуется совет. Лена Guest /22.02.2006 23:16/
(Olena Bilyk @ 22.02.2006 22:06) Дорогие коллеги! Посоветуйте как заморозить клетки асцитической жидкости, взятые непосредственно у онкологических больных. Я первый раз с этим работаю, требуется совет. Лена Точно также, как и все остальные клетки морозят. Сходите на сайт celltransplant.ru - много спецов по этой тематике. Гость /23.02.2006 18:52/
Уважаемые коллеги! Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре? Линия HaCaT(кератиноциты). Заранее огромное СПАСИБО гость: Ю /09.03.2006 18:15/
(Гость @ 23.02.2006 17:52) Уважаемые коллеги! Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре? Линия HaCaT(кератиноциты). Заранее огромное СПАСИБО Guest /09.03.2006 18:27/
(Гость @ 23.02.2006 17:52) Уважаемые коллеги! Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре? Линия HaCaT(кератиноциты). Заранее огромное СПАСИБО Можно использовать облучение ультрафилетом (минут 20), или митомицин С, 50 мкг/мл 1-2 час, или актиномицин Д (1-5 мкг/мл, колхицин и др клеточные яды и противоопухолевые химиопрепараты. А у меня к Вам вопрос как раздобыть клетки HaCaT? Уже давно ищу в бывшем СССР. Заранее спасибо. Гость /10.05.2006 17:59/
Здравствуйте! Напишите ,пожалуйста,можно ли для снятия клеток NIH3T3 с чашки вместо трипсина использовать раствор Версена и как лучше это выполнить, чтобы получить максимально возможное количество клеток (надо для миграции)? заранее СПАСИБО. ммм /11.05.2006 12:07/
---Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре? Линия HaCaT(кератиноциты). НАГРЕТЬ ГРАДУСОВ ДО 50-60. поменять рН запредельно, или налить окислителя. а еще формалинчик тоже хорошо. bapik /12.09.2006 11:18/
Всем привет! Коллеги помогите пожалуйста, как прокультивировать некоторое время опухоль вынутую из животного, а потом сделать перевивку уже на несколько животных. Извиняюсь за сумбурное изложение, в таких делах я просто чайник. Посоветуйте, что почитать. СПАСИБО. Андрей. Firefly76 /28.11.2006 20:01/
Коллеги, посоветуйте, pls, что делать, если при культивировании клеток среда (DMEM/10%CBS) быстро защелачивается (приобретает фиолетовый оттенок. Клетки пойкилотермных животных, Т=26С, посуда NUNC. CO2 инкубатора нет, но введение газа в емкость не предотвращает этот процесс. ЗАРАНЕЕ БЛАГОДАРЕН. Ksiysha /30.11.2006 17:21/
а клетки у вас там вообще делятся? Ksiysha /30.11.2006 17:26/
(Гость @ 10.05.2006 17:59) Здравствуйте! Напишите ,пожалуйста,можно ли для снятия клеток NIH3T3 с чашки вместо трипсина использовать раствор Версена и как лучше это выполнить, чтобы получить максимально возможное количество клеток (надо для миграции)? заранее СПАСИБО. Можно и версеном, но подержать в инкубаторе придется подольше и снимать механически Гость /23.01.2007 17:50/
Глубокоуважаемые коллеги! Посоветуйте простому генному механику... Задача - зафиксировать клетки на чашке, затем провести иммуноокрашивание рекомбинантного белка. Попробовали: фикс- 4%параформ на PBS+Tw20 0.01%, отмывка, иммуноокраш. с помощью Fab-фрагментов- POD, субстрат ТМБ. Получилось грязно, видна только внеклеточная локализауия белка. Кто-нибудь пробовал сапонин (? конц, время) для улучшения проникновения АТ в клетки? И какие субстраты лучше для такой работы (есть Fab'ы меченные АР) Спасибо кatia@ibch.ru guest: ммм /24.01.2007 12:20/
---зафиксировать клетки на чашке. Клетки то животные или бактериальные? Если животные то можно попробовать мягкую фиксацию типа метанол уксус или 80% ацетон при этом и доступ к внутренностям клеточным открывается. Получилось грязно, видна только внеклеточная локализауия белка. Может это неспецифика? Клетки-то наверное можно отмыть как-то от внеклеточного белка перед фиксацией. --есть Fab'ы меченные АР Для такой хрени используют бром -хлор-индолил фосфат с нитросиним тетразолиевым в паре. Ну и буфер щелочной для субстрата. curious67 /18.02.2007 16:24/
2 guest: ммм Спасибо за ответ! Пробовала 80% ацетон и 4%парафрорм на PBS С ацетоном лучше, для параформа требуется обработка сапонином (чтобы мембраны разрушились и АТ проникли внутрь). А насчет отмывки - это не грязь и не неспецифика, белок имеет внутри- и внеклеточную локализацию (что видно на флуор. микроскопе, поскольку мы имеем дело с аналогом GFP). А субстрат у меня ТМБ. Он выцветает при хранении. Попробую этот ваш бром-хлор... Спасибо за Ваши комментарии!!! Guest /18.02.2007 17:04/
(curious67 @ 18.02.2007 15:24) curious67, Вы что, пол сменили? curious67 /18.02.2007 19:04/
быстрая реакция! Спасибо за внимание к моей персоне Это другой пользователь, который не спросясь зашел, но не в курсе несколько, как логиниться и тп. Потому как не имеет времени переливать из пустого в порожнее, как мы с Вами. Попробую убедить завести себе ник. Пока не обижайте уж pchelinka /19.02.2007 09:44/
[Всем привет! Коллеги помогите пожалуйста, как прокультивировать некоторое время опухоль вынутую из животного, а потом сделать перевивку уже на несколько животных. Извиняюсь за сумбурное изложение, в таких делах я просто чайник. Посоветуйте, что почитать. СПАСИБО. Андрей.quote] мы перевивали мышей сразу (не культивируя дополнительно) - вынутую из мышки опухоль, (асцитная или солидная), переносилась в буфер Хенкса, или в RPMI, объем которых должен быть небольшой - 1-2 ml и температуры чел тела (капля раствора на тыльной стороне руки не чувствуется). Далее концентрация клеток в растворе разводилась до 10*6 (степ) в ml и по 400-500 мкл вводилась в животное уколом в брюхо - для брюшного асцита. Для других опухолевых клеток перевиваемая концентрация может быть другая. Гость /17.04.2007 10:26/
Дорогие коллеги, Чем принципиально отличается работа с культурами клеток насекомых, например, от культур гибридом? Мне скоро предстоит работать с первыми и хочется быть немножечко "в танке"..... Спасибо..... kolya1984 /26.10.2007 13:10/
Помогите пожалуйста. Кто знает что - нибудь про культивирование нервной ткани расскажите методику и материалы. Bogatick /07.11.2007 19:05/
Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"? guest: ммм /07.11.2007 20:49/
---Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"? Грубо! - Между субстратом и рецепторами адгезии образуются кальциевые мостики. типа СОО- +Са+ -ООС. Bogatick /08.11.2007 19:08/
ммм, спасибо Гость /12.11.2007 20:00/
можно ли заменить со2 инкубатор обычным термостатом при приготовлении препаратов хромосом клеток костного мозга для fish-диагностики и цитогенетического исследования. guest: ммм /12.11.2007 20:29/
Можно попробовать два варианта первый использоавать среду с HEPES буфером второй ставить чашку в эксикаторе в котором погасла горящая свеча(от недостатка кислорода). Гарантий никаких при любом из способов, хотя первый предпочтителней. Гость /16.11.2007 14:21/
Bogatick /07.11.2007 19:05/ Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"? кадгерины кальций-зависимы Гость /16.11.2007 14:21/
Bogatick /07.11.2007 19:05/ Почему благодаря EDTA,содержащемуся в версене, клетки адгезионных культур сходят с поверхности? Почему лишение клеток двухвалентных ионов заставляет их "покидать насиженные места"? кадгерины кальций-зависимы Гость /19.11.2007 12:32/
подскажите кто нибуть самый простой и ефективный метод приготовленния Brhadyrizobium japonicum для проведения фореза polymerase /23.01.2008 23:19/
Объясните, пожалуйста. Трансфекция эу-клеток. Почему, когда мы проводим трансфекцию одновременно двумя плазмидами, считается, что во все клетки попадают обе? Пусть создается смесь трансфекционного реагента и двух плазмид, а затем раскапывается на клетки. Тогда, теоретически, у нас будет 4 вида комплексов: агент, не захвативший ничего, агент захвативший плазмиду1, плазмиду2 и обе. И, если в плазмиды включена кднк GFP, то визуально ну ни как отличишь эти комплексы ( ну то есть светится клеточка, а какая?)! Я в тупике. Нора /05.06.2008 16:24/
Здравствуйте, коллеги! Подскажите, пожалуйста, при получении первичных кератиноцитов каким образом помещают биоптат в раствор диспаза? И каким образом наносить коллаген на культуральный пластик, в чем его предварительно растворить и чем дополнить? Огромное спасибо! myosotica Гость /19.09.2008 13:33/
Здравствуйте коллеги! Подскажите пожалуйста где можно найти протокол получения подкожных человеческих фибробластов? Очень нужно :mol: chatter /19.09.2008 17:43/
(Гость @ 23.02.2006 18:52) Уважаемые коллеги! Подскажите пожалуйста как можно быстро, дёшево и сердито убить клетки в культуре? Линия HaCaT(кератиноциты). Заранее огромное СПАСИБО Хромпиком. chatter /19.09.2008 17:53/
(polymerase @ 23.01.2008 23:19) Объясните, пожалуйста. Трансфекция эу-клеток. Почему, когда мы проводим трансфекцию одновременно двумя плазмидами, считается, что во все клетки попадают обе? Пусть создается смесь трансфекционного реагента и двух плазмид, а затем раскапывается на клетки. Тогда, теоретически, у нас будет 4 вида комплексов: агент, не захвативший ничего, агент захвативший плазмиду1, плазмиду2 и обе. И, если в плазмиды включена кднк GFP, то визуально ну ни как отличишь эти комплексы ( ну то есть светится клеточка, а какая?)! Я в тупике. Один липофектаминовый комплекс включает в себя много-много плазмид. При эквимолярном соотношении векторов в смеси довольно сложно себе представить, как липофектамин матерясь ползает по пробирке, собирая исключительно GFP-вектора лишь бы вам нагадить. Гость /09.02.2009 18:19/
Коллеги, есть серьезные подозрения, что фетальная сыворотка Hyclon заражена микоплазмой. После фильтрации предварительно вылеченные клетки вроде не приобретают микоплазму (по тесту с DAPI). Есть ли у кого-нибудь опыт очитки сыворотки (а е клеток) от микоплазмы? Сами клетки прекрано лечатся Mycoplasma Removing Agent производства ICN. Но с сывороткой непонятно что делать. Главное, много ее накупил. Гость /27.02.2009 14:10/
это не чиститься, насколько мне известно, просто обращаетесь к производителю и они ОБЯЗАННЫ поменять вам сыворотку на нормальную Guest /27.02.2009 20:36/
(Firefly76 @ 28.11.2006 19:01) Коллеги, посоветуйте, pls, что делать, если при культивировании клеток среда (DMEM/10%CBS) быстро защелачивается (приобретает фиолетовый оттенок. Клетки пойкилотермных животных, Т=26С, посуда NUNC. CO2 инкубатора нет, но введение газа в емкость не предотвращает этот процесс. ЗАРАНЕЕ БЛАГОДАРЕН. 1. Если добавляете НЕРЕS, не добавлять. 2. Увеличить на порядок концентрацию клеток (если не слишком большая) 3. Увеличить концентрацию фетальной сыворотки (смело можно до 20%) 4. В свое время, когда у нас не было СО2 инкубатора , мы добавляли СО2 в эксикатор с помощью бытового сифона и балончиков с СО2 для сифонов (сейчас их продают для пистолетов), но добавляли каждые 6 часов и крышку эксикатора смазывали глицерином. 5. каждые 4 -6 часов менят среду культивирования на новую Успехов Гость /28.02.2009 02:31/
Коллеги помогите!!! Для отработки методики нужны эпителиальные клетки кишечника человека. Конечно хотелось бы нормальных не раковых клеток, но вряд ли существуют такие клеточные линии. Подскажите пожалуйста какую использовать клеточную линию которая максимально сохранила свойства эпителия кишечника человека. katya-akts /16.03.2009 15:32/
Вопрос к Гостю, писавшему про сыворотку HyClone и микоплазму: не могли бы Вы уточнить номер партии сыворотки, на которую такие подозрения? моя почта katya_akts{sobaka}mail.ru galina.glousker /22.03.2009 14:47/
Уважаемые коллеги, нужен совет: культура неиммортализованных человеческих фибробластов ночь простояла в пониженной концентрации углекислого газа - кто-то умный перекрыл вентель на баллоне. Клетки вроде живы, но мы работаем с ДНК - кто-нибудь знает, насколько серьезны могут быть повреждения у выживших клеток и как это проверить? Заранее спасибо Гость /27.03.2009 11:00/
Добрый день! Подскажите, пожалуйста! Я хочу выделить белок из эндотелиальных микрочастиц плазмы крови - как можно разрушить мембрану, но так, чтобы не денатурировал белок? - Может быть, ультразвуком, но в течение какого времени? Гость /02.04.2009 14:36/
Здравствуйте, подскажите , пожалуйста, как фиксировать клетки млекопитающих, чтобы посмотреть внутриклеточную локализацию рекомбинантного белка с GFP? alsan /25.10.2014 20:52/
Подскажите пожалуйста, как организовать работу с суспензионными культурами клеток. В каких колбах качать, какие крышки можно использовать? Или только Corning PC c вент крышкой? MMM /26.10.2014 08:23/
(alsan @ 25.10.2014 21:52) Подскажите пожалуйста, как организовать работу с суспензионными культурами клеток. В каких колбах качать, какие крышки можно использовать? Или только Corning PC c вент крышкой? Если вы не собираетесь растить их мегалитрами, то подходит ЛЮБАЯ культуральная посуда для адегизионных культур. Так же можно использовать ПС чашки для бактерий. Качать в колбах низя. Они не бактерии потоки жидкости не любят. Их если в масштабах литров растят, то при ооочень медленном перемешивании в лабах обычно с помощью ролерной технологии, а в производстве в спец ферментерах. alsan /26.10.2014 16:37/
Т.е. суспензию без перешивания? В CO2? Или можно и с резиновой крышкой? guest: ммм /26.10.2014 18:07/
В СО2 конечно, бЕз СО2 можно, но на спец среде и не всякую суспензию. При большом объеме - сотни мли более - либо нужно много мелкой посуды, либо все таки перемешивание нужно но мееедленное типа один цикл в 5-10 минут, можно еще медленнее. Dr. Lektor /03.08.2016 13:21/
Уважаемые коллеги. Подскажите пожалуйста как получить чистую линию макрофагов человека из венозной крови, как их содержать и какова их жизнеспособность? Заранее благодарен. CowDoc /20.09.2016 19:07/
(MMM @ 26.10.2014 08:23) Качать в колбах низя. Они не бактерии потоки жидкости не любят. Их если в масштабах литров растят, то при ооочень медленном перемешивании в лабах обычно с помощью ролерной технологии, а в производстве в спец ферментерах. Не слушайте! Все зависит от вида клеток и среды. И опыта. Посмотрел бы я на вас, как бы вы [/b]очень медленно перемешивая выращивали бы простейшие BHK-21 watchesbiz /24.11.2021 15:10/
|
ГЛАВНАЯ ·
ПРОЕКТ ·
СПРАВОЧНИК ·
МЕТОДЫ ·
РАСТВОРЫ ·
РАСЧЁТЫ ·
ЛИТЕРАТУРА ·
ЗАДАЧИ ·
ФИРМЫ ·
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
|