форез в 0.3% агарозе (лучше в холодной комнате). Маркер - лигированный на себя фаг лямбда. Подходящая для конструирования библиотеки DNA должна идти достаточно компактным бэндом выше ~100kbp. Шмера быть не должно.
Аналитический недорестрикт
приготовить 9 пробирок "N1"-"N9" в бане 0oС (из расчета ~0.75µg ДНК на пробирку); общая смесь 166.7µl (7.5µg DNA в 1х "M" рестрикционном буфере), разаликвотить:
рестриктазу Sau 3A развести до концентрации 0.5u/µl в 1х "M" буфере (V~5µl);
добавить к "N1" 4µl разведённого фермента, пипетировать ~10 раз обрезанным желтым типом. 1/2 материала перенести в следующую пробирку, следующий шаг - новым типом и т.д. в 10ю пробирку ничего переносить не надо, она будет служить контролем "без рестриктазы" (9 пробирок обрабатываются за ~10');
37oС, 1h, слегка помешивая каждые 10-15';
+ 1.5µl буфера для внесения SDS(+);
форез (0.3% агароза) (лучше в холодной комнате);
рассчитать концентрацию фермента, при которой максимальное количество DNA имеет длину 14-24kbp.
Препаративный недорестрикт
препаративная рестрикция 3х по 100µg DNA резать в условиях
форез - контроль каждой фракции; если рестрикция прошла удачно - объединить, если "промахнулись" - взять только удачные; поставить дополнительные (уже скорректированные) препаративные рестрикции.
Фракционирование ДНК
в пробирке ротора SW40 приготовить градиент
25->5% NaCl (w/v)
3mM EDTA, pH 8.0;
наслоить DNA в объеме <200µl (но не более 150µg);
ЦФ 37 krpm NT, 4.5h; разгонять при низком ускорении, останавливать центрифугу в режиме без торможения;
перенести фракции по 250µl в пробирки с 1.25ml 77% EtOH;
>1h, -20oC;
ЦФ NT, 10';
осадок дважды промыть охлаждённым 70% EtOH;
1/20 материала на форез (0.3% агароза), выбрать пробирки, содержащие фрагменты DNA длиной 14-24kbp (нужный диапазон размеров обычно находится в районе 14-16ойпробирок);
объединить содержимое нужных пробирок;
определить концентрацию, упаковать аликвоту;
определить титр библиотеки (высеяв 1µl, 10-2µl, 10-4µl);
добавить DMSO до 7%, разаликвотить в подписанные пробирки по 105pfu (для дрозофилы), хранить при –70oС.
N – размер библиотеки;
p – вероятность, что уникальный фрагмент будет присутствовать в библиотеке;
lфр – средний размер клонируемого фрагмента;
L – размер гаплоидного генома.
Для дрозофилы при клонировании в фаге лямбда: lфр=1.5x104bp; L=1.4x108bp =>
N=-9.3х103ln(1-p)
p
0.75
0.9
0.999
0.99999
N (x104)
1.2
2.1
6.4
10.7
Среднее количество клонов, которое получается при скрининге библиотеки "точечным" зондом: n = N lфр/ L; для дрозофилы: n ~10-4N.
Нужно иметь в виду, что представленные выше вероятности рассчитывались в предположении, что "Sau3A недорез" происходит равномерно. В реальном геноме имеются участки аномально высокой и аномально низкой плотностью Sau3A сайтов.
По пунктам
п. 1.
На качестве фореза (особенно при такой низкой концентрации агарозы) может сильно сказаться "перегруженность" ячейки, поэтому имеет смысл гнать несколько дорожек с разным количеством DNA.
Особенности работы с низкопроцентными (0.3%) гелями:
в плашку для электрофореза залить "подложку" - слой агарозы 1.5-2.0% толщиной ~2-3 mm, дать застыть;
на этой подложке закрепить гребенку так, чтобы между зубцами и подложкой было расстояние 1-2mm;
залить 0.3% агарозу (лучше в холодной комнате);
гребенку удалять только под слоем буфера, иначе ячейки слипнутся.
ВНИМАНИЕ! Работать в холодной комнате. Гель очень хрупкий, все манипуляции проводить только вместе с 2% подложкой; не лить буфер на поверхность геля.
п. 2-8.
В этом разделе определяется количество Sau3A, которое за 1h при 37oС дает максимальное количество фрагментов в диапазоне 14-20kbp’s. Для ориентировки - у нас получалось ~0.015-0.03u на 0.75µl DNA.
п. 2.
0oС - чтобы рестрикция в различных пробирках шла одно и то же время.
п. 4.
Приготовление двукратных разведений фермента. Геномная DNA весьма вязкая, хорошо перемешать фермент непросто. В то же время, если смешивать слишком интенсивно, можно раздробить DNA. Разумный компромисс - смешивать и в начале и в ходе инкубации на 37oС)
п. 6.
Остановка рестрикции. Буфер для внесения не должен содержать ксиленцианол, иначе он, находясь в пределах 14-20kb, будет мешать анализу.
п. 9.
Сайты рестриктазы Sau3A расположены в среднем через 250bp. Однако, существуют зоны, где их аномально много или аномально мало. Чтобы такие зоны не избежали клонирования, применяются рестрикции с заниженной (соответственно - завышенной) концентрацией рестриктазы.
Стоит обратить внимание, что равномерно смешать фермент с DNA трудно, поэтому вначале нужно развести необходимое количество фермента в 1х М буфере в объеме ~ 1/5 суммарного объема рестрикции и только затем смешивать его с DNA. Стоит дополнительно помешивать пробирку во время инкубации на 37oС каждые 10-15'.
п. 10.
Обычно оказывается, что рестриктазы взято больше, чем нужно и приходится ставить реакцию "1/3" в новых условиях (вполне вероятно, что стоит сразу ставить четыре рестрикции).
п. 11.
Импортные мешалка и перистальтический насос (иначе раствор будет идти толчками), не забыть предварительно протолкнуть воздушный пузырек в смесителе.
Мы предпочитаем наслаивать градиент сверху. Чтобы не нарушать градиент, можно положить в пробирку маленький кусочек пробки и наносить раствор на него.
Смешиваемые растворы имеют различную плотность, поэтому равные объёмы в смеситель не нальёшь. Если вы хотите, чтобы после открывания крана смесителя растворы остались в равновесии, надо наливать (для ультрацентрифужной пробирки объёмом Vo):
V25 = Vo/(1+p25/p5) = 0.471Vo = 5.65ml для Vo = 12ml
V5 = Vo/(1+p5/p25) = 0.529Vo = 6.35ml для Vo = 12ml
п. 13.
Уравновешивать пробирки, добавляя 1х М буфер.
п. 18.
Осаждать (и анализировать) можно не все фракции, а через одну (две).
п. 20.
Мы проводим упаковку следующим образом:
заранее подготовить клетки;
утром упаковать DNA;
высеять 10х разведения для определения титра библиотеки;
через 6-7h, когда появятся фаговые бляшки, рассчитать титр;
к остаткам библиотеки добавить DMSO до 7%, расфасовать по 106pfu аликвотам (для дрозофилы), подписать и заморозить (весьма распространенно беспокойство по поводу качества DMSO, длительное время хранившегося при NT. Мы убеждены, что, если речь идет о хранении замороженных клеток, то беспокоится не о чем).
высеять необходимое количество;
п. 22.
Не надо откладывать заморозку библиотеки. Через неделю титр может упасть раз в десять.
Подписывать аликвоты (вектор, источник библиотеки, дата, титр) надо очень аккуратно, т.к. хорошая библиотека может пригодится и через год и через 5 лет.