препаровальный столик: можно приготовить из куска картона/пенопласта (но лучше всего – пробки), покрытого ватманом на полиэтиленовой основе/полиэтиленом и 2-3 слоями фильтровалки;
ножницы: (i) маленькие-остроконечные и (ii) тупые (удобно пользоваться, когда есть опасность повредить соседние органы);
пинцеты (минимум два, желательно иметь и по паре тупых и острых);
кронцанги - желательно;
канцелярские кнопки - для фиксации на препаровальном столике (лучше - с "высокой рукояткой");
20-50ml шприц и к нему обрезанные (чтобы можно было надеть на шприц) 200 µl типчики для промывки кишок;
салфетки (удобнее, если разрезанные на небольшие кусочки);
запас жидкого азота для хранения органов;
подписанные (по названиям органов) 50 ml пробирки с проколотыми дном и крышками (чтобы не взорвались) в жидком азоте;
лёд.
Умерщвление мышки
Разрыв шейных позвонков
поместить мышку на сетку, как показано на рисунке, удерживая за хвост;
потянуть за хвост (не слишком сильно) - мышь, сопротивляясь, будет тянуться вперёд, держась за прутья - это исходное положение, дальше желательно работать уверенно и быстро;
большим пинцетом или ножницами прижать (достаточно плотно, чтобы не вывернулась) голову мыши (сразу за затылком) к сетке;
потянуть за хвост одновременно поднимая мышь до угла ~90o (вы должны почувствовать разрыв позвонков).
Газовая камера
собрать "газовую камеру";
накрыть крышкой, дать постоять ~5';
мышку положить на поднос, закрыть крышку;
через ~2' - все готово.
Предварительный осмотр
определить, самец это или самка;
состояние шерсти - должна быть чистой и ровной (это критерий нормального самочувствия);
нет ли дегидратации (защемлённая кожа должна быстро возвращаться на место);
Препарирование
намочить шерсть этанолом (чтобы она не лезла внутрь и ради дезинфекции);
зафиксировать мышку на столике брюшком кверху (проткнув кнопками лапки);
сделать три разреза кожи брюшка (но не брюшной стенки!):
(1) начало - антериор по отношению к мочевому отверстию, конец - под подбородком;
(2) и (3) начало - там же, где начало первого разреза, конец - у колен;
раскрыть кожу, зафиксировать;
если нужны - отделить (prepuital glands) /Pg/;
отделить доступную часть (L1-L5) лимфатических узлов (lymph nodes) /Ln/;
отделить слюнные железы (salivary glands) /Sg/
;
Расположение лимфатических узлов
Название узла
Название узла (рус.).
Парные?
Расположение.
L3
axillary
Подмышечные
+
Подмышка
L4
brachial
Брахиальные.
+
Располагаются на двуглавой мышце, под грудной клеткой.
L2
deep cervical
Глубокие шейные
+
Скрыты за слюнными железами.
L5
inguinal
Паховые
+
Прикреплены к коже паха.
lumbar
Поясничные.
+
Антериально по отношению к разветвлению брюшной аорты.
mediastinal
Грудинные.
+
В области тимуса.
mesenteric
Брыжеечные.
NO
Брыжейки тонкой кишки и поджелудочной железы.
L6
popliteal
Подколенный.
+
За коленом, между приводящей и полумембранной мышцами.
pyloric (pancreatic)
Поджелудочные.
+
Антериор по отношению к поджелудочной железе, рядом с привратником желудка
renal
Почечные.
+
Между аортой и почками.
sacral
Крестцовый.
NO
Постериально по отношению к разветвлению брюшной аорты.
sciatic
Седалищные.
+
На спине, под седалищным нервом.
L1
superficial cervical
Внешние шейные.
+
Антериор по отношению к слюнным железам.
если мышь - самка, причем беременная, кормящая или весьма упитанная - можно отделить молочные железы (mammary glands) /Mg/ (творожистая ткань в брюшном эпидермисе);
отрезать нижнюю челюсть (разрезав мандибулярные соединения), срезать язык (tongue) /Ton/;
отделить мозг:
разрезать ножницами шею;
отделить голову, оставшуюся тушку накрыть Saran-wrap, сверху насыпать лёд;
снять с головы шерсть и выбросить, обычно при этой операции обнажаются находящиеся над глазами (Harderian gland) /Hg/.;
острым пинцетом проделать ряд дырочек по средней линии черепа;
пинцетом разломить черепную коробку на две половины (концы пинцета должны быть направлены вверх, чтобы не повредить мозг; следить, чтобы не оторвались слабо прикреплённые обонятельные доли);
перевернуть череп, пинцетом помочь мозгу выскользнуть вниз;
относительно легко отделяются:
- обонятельные доли (olfactory lobes) /B-O/(лежат снаружи, проблем быть не должно);
- большие полушария (cerebrium) /B-e/(аккуратно придерживая пинцетом за medulla поставить мозг на антериор часть, аккуратно отогнуть/расправить большие полушария, разорвать пинцетом (рвутся очень легко) нервы, соединяющие большие полушария с medulla;
- (cerebellum) (отогнуть/расправить cerebellum (сбоку), разорвать пинцетом (рвутся очень легко) нервы, соединяющие cerebellum с medulla) /B-ll/;
- (medulla) (остаток) /B-M/;
аккуратно разрезать брюшную мышцу до грудины, вдоль рёбер и вдоль позвоночника (можно использовать как мышечную ткань);
отделить мочеполовую систему (urogenital system):
если самец
а) отделить тестикулы (testicle) /Tc/ (мешочки, содержащие тестикулы, нужно освободить от жира, вытянуть вместе с (epididymes), обрезать (vas deferens) - они соединяются с мочеиспускательным каналом (uretra) рядом с простатой);
б) отделить seminal vesicles /Sv/;
если самка
освободить от жира матку (uterus) /Ut/ с яичниками (ovaries) /Ov/ и фаллопиевыми трубами (fallopian tube) ;
отделить пищеварительную систему:
отрезать как можно более постериор толстую кишку (colon). Аккуратно размотать кишки до желудка, при этом не лениться аккуратно отцеплять брыжейку;
Вн!!! отделение поджелудочной железы: кишка будет легко вытягиваться, пока дело не дойдёт до поджелудочной железы (рыжевато-коричневая), в этом же месте находятся поджелудочные лимфатические узлы, но их не увидеть - слишком мелкие;
При разматывании последовательно (с заду к переду) отделяются следующие зоны пищеварительной системы:
отделить прямую кишку (colon) /Co/, промыть её снаружи и изнутри (шприцом) изотоническим раствором;
отделить тонкую кишку (intestines) /In/ (отрезать от желудка по двенадцатиперстной кишке), промыть её снаружи и изнутри (шприцом) изотоническим раствором;
обрезать пищевод над желудком (stomach) /St/ (отступив от него на 0.25-0.5mm), сполоснуть его снаружи, разрезать, вывернуть наизнанку, сполоснуть изнутри;
отделить печень (liver) /Liv/:
обрезать вену с грудной стороны печени;
вытянуть (антериор) пищевод;
отделить печень, вытащить из неё сгусток крови (если есть), сполоснуть в изотоническом растворе;
Вн!!! к медианной доле прикреплён желчный пузырь;
отделить почки (kidney) /Kid/ с надпочечниками (!!!) (adrenal glands) /Ad/, снять оболочку (подсунув пинцет под оболочку в районе почечной лоханки); надпочечники обычно остаются прикреплёнными к оболочке (надпочечники самцов по размеру больше, чем надпочечники самок);
отделить органы грудной клетки:
вырезать грудину - приподнять её пинцетом, ножницами проткнуть диафрагму и разрезать до шейного кольца (концы ножниц приподнимать кверху, чтобы не повредить внутренние органы). Вн!!! Тимус /Ty/ часто остаётся прилепленным к грудине;
зацепив за пищевод (esophagus) вытянуть лёгкие (lung) /Lg/ и прикреплённые к ним органы (обрезая ножницами соединение с позвоночником), отделить пищевод и трахею (trachea) от глотки как можно более антериор (чтобы не потерять щитовидные железы (thyroids); Но!!! - вряд ли это имеет смысл, если мышь убита разрывом шейных позвонков);
отделить (если требуется) щитовидную железу (рыжевато-коричневая, на антериор конце трахеи);
отделить тимус (thymus) /Thy/ (прозрачный, расположен над/или вентрально по отношению к сердцу), у молодых мышей он относительно большой, но с возрастом уменьшается. Рядом с ним находятся два небольших грудинных лимфоузла (mediastinal lymph nodes), лучше их отделить (расположены дорсо-латерально по отношению к тимусу);
В наших руках процедура от убийства мышки до извлечения всех перечисленных выше органов занимала 1h (правда, начиная с третьей мышки);
Сразу после извлечения орган надо сполоснуть в изотоническом растворе и заморозить в жидком азоте. Такой способ весьма слабо отмывает от крови. Нам кажется, что мы слышали о способе, когда через сердце можно промыть все ткани мыши.
По пунктам
п. 1.
Выбор из этих двух способов зависит от того, что вы собираетесь делать с тканями мыши дальше. "Газовая камера" практически не повреждает внешнюю структуру тканей и, видимо, оптимальна для морфологического исследования. В то же время CO2 проникает ко всем клеткам организма, гибель происходит на клеточном уровне и для молекулярных исследований это более деструктивный способ.
Разрыв шейных позвонков вызывает кровоизлияние в области шеи.
п. 4.
Мышь будет дёргаться и раскрывать рот ещё ~1', но это уже конвульсии после смерти.
п. 7.
Поднос не должен быть холодным (!) - пластиковый или деревянный. Сверху положите фильтровалку. Поднос должен быть достаточно большим, чтобы животное не свалилось в сухой лед.
п. 17.
К тому же, эти лимфатические узлы и самые крупные.
Некое представление о расположении внутренних лимфоузлов (L2 и L4): если смотреть на зафиксированную мышь сверху - они находятся под соответствующими внешними: L1 и L3.
п. 19.
Беременная - имеется в виду достаточно поздняя стадия беременности.