Маркер, имеющийся в наших руках - "Supercoiled DNA ladder" - точная копия, а "1 kb DNA ladder" -модифицированная версия маркеров с тем же названием фирмы "Stratagene" #201116 и #201115, соответственно. Модификация - клонирование двух 0.25-1.5kb фрагментов вместо одного (см. ниже). Это делает маркер более однородным по интенсивности.
Приготовление Supercoiled DNA ladder
(2; 3; 4; 5; 6; 7; 8; 9; 10; 12kbp)
выделить pMr2, pMr3, ..., pMr12 (так, чтобы не было RNA);
спектрофотометрически определить концентрации;
приготовить смесь с общей концентрацией 0.5µg/µl: смешать индивидуальные компоненты так, чтобы концентрация pMr7 составила 125ng/µl, а каждой из остальных девяти плазмид - 41.7ng/µl.
выделить pMr2+2, pMr3+2, ..., pMr6+2, pMr7, pMr8, ..., pMr12 (лучше так, чтобы не было RNA);
резать их по отдельности рестриктазой EcoR I; проконтролировать полноту рестрикции;
чистить Ф:Х; Х; спектрофотометрически определить концентрации;
приготовить смеси с общей концентрацией 376ng/µl {при этом в 1µl оказывается 396fmol фрагментов разной длины} (0.25-6kb DNA ladder) и 250ng/µl (7-12kb DNA ladder) так, чтобы концентрация индивидуальных компонентов составила:
0.25-6kb DNA ladder
7-12kb DNA ladder
Название:
Концентрация [ng/µl]:
Название:
Концентрация [ng/µl]:
pMr2+2
95
pMr7
50
pMr3+2
67
pMr8
50
pMr4+2
69
pMr9
50
pMr5+2
70
pMr10
50
pMr6+2
75
pMr12
50
в 1µl этих смесей содержатся следующие количества фрагментов различной длины:
0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders безусловно дешевле, удобнее в приготовлении и в использовании, чем маркеры на основе фага лямбда. У него лишь один существенный недостаток: он дает очень сильный фон при гибридизации с фрагментами (даже очищенными), клонированными в плазмидных векторах. Приходится наносить маркер через пустую дорожку от "геномных" полос и отрезать перед переносом. Кроме того, в качестве некоторых вставок были использованы фрагменты из фага лямбда (очень неудачная идея!), так что с зондами, вырезанными из лямбда-векторов этот маркер тоже фонит. Впрочем, аналогичные проблемы возникают и с лямбда/HindIII при гибридизации с фрагментами, вырезанными непосредственно из фагового вектора.
Все используемые плазмиды имеют слабый контроль и ампициллиновую селекцию. Приблизительный выход из 250ml LB/Amp: ~1mg (для pMr2 и pMr2+2) и ~2.6mg для всех остальных. Поэтому, для того, чтобы получить более или менее сбалансированные количества pDNA:
* если речь идет о приготовлении "Supercoiled marker" надо брать для pMr2 объем среды в 2 раза больший, чем для остальных плазмид;
* если речь идет о приготовлении "1kb marker" надо брать для pMr2+2 объем среды в 4 раза больший, чем для остальных плазмид.
Название плазмиды:
Размер[bp]:
Количество сайтов рестрикции EcoR I:
Фрагменты, получающиеся в результате рестрикции EcoR I:
Относительное количество сайтов EcoR I:
Приблизи- тельное количество EcoR I, [u]:
pMr2
2000
1
1x2000
(6)
(6)
pMr3
3000
1
1x3000
(4)
(4)
pMr4
4000
1
1x4000
(3)
(3)
pMr5
5000
1
1x5000
(2.4)
(3)
pMr6
6000
1
1x6000
(2)
(2)
pMr7
7000
1
1x7000
1.7
1.5
pMr8
8000
1
1x8000
1.5
1.4
pMr9
9000
1
1x9000
1.3
1.2
pMr10
10000
1
1x10000
1.2
1.1
pMr12
12000
1
1x12000
1
1
pMr2+2
2500
3
1x2000+2x250
14.4
13
pMr3+2
4000
3
1x3000+2x500
9
8
pMr4+2
5500
3
1x4000+2x750
6.5
6
pMr5+2
7000
3
1x5000+2x1000
5.1
5
pMr6+2
9000
3
1x6000+2x1500
4
4
По пунктам
п. 5.
Обращаем ваше внимание на то, что когда режутся приблизительно одинаковые массы плазмид, молярное количество EcoR I сайтов в реакции сильно различается. Кроме того, EcoR I относится к тем рестриктазам, которые способны работать и в течение ночи, т.е. количество фермента может быть уменьшено В таблице приведены приблизительные количества EcoRI, необходимые для того, чтобы порезать ON 100µg соответствующих плазмид.
п. 3, 7.
Лучше, перед тем как смешивать большой объём маркера развести индивидуальные компоненты (понемногу!!!) до конечной концентрации и проконтролировать на форезе, что получилось.
0.25-6kb и 7-12kb DNA ladders можно при желании объединить в один 0.25-12kb DNA маркер.
Для получения отчетливой картинки достаточно наносить 0.2-0.5µl смеси на одну дорожку геля.
Мы предпочитаем хранить основной сток в морозильнике на -20oС и готовить из него по мере необходимости "рабочий сток", который держим при +4С. "Рабочий сток" составляется таким образом, чтобы 10µl давали не слишком яркую, но вполне читаемую картинку на форезе: