Область начала репликации одноцепочечных бактериофагов можно разделить на две части: 1) сайт инициации, 2) сайт терминации синтеза DNA. В векторе лямбда ZAP эти сайты клонированы раздельно и содержат внутри себя последовательность pSK(-). Фаг-хелпер проводит выщепление фагемиды pSK(-) из лямбда ZAP, ее упаковку и секрецию в среду. Штамм SOLR устойчив к инфекции фагом лямбда. Он так же не способен комплементировать амбер-мутацию фага ExAssist. Без этой супрессии ExAssist не способен осуществлять свою репликацию. Т.о. в этих клетках могут размножаться только фагемиды pSK(-).
Обе культуры можно хранить при +4oС в течение недели.
п. 4, 5.
Клетки XL-1Blue заражаются лямбда ZAP и одноцепочечным фагом-хелпером ExAssist, инкубация без встряхивания на 37oС в п.5. требуется для заражения фагом лямбда.
п. 7.
Фаг-хелпер проводит выщепление фагемиды pSK(-) из лямбда ZAP, ее упаковку и секрецию в среду.
п. 9.
Тепловая обработка убивает все клетки E. coli, на фаги она не действует.
п. 10.
Осаждение погибших клеток. В супернатанте остаются: выщепленная фагемида, фаг-хелпер, фаг лямбда ZAP.
п. 11.
Штамм SOLR обладает забавным свойством: плазмидная DNA, полученная из этого штамма образует широкий спектр конкатамеров. Эта особенность способна вызвать замешательство при сравнении ее на электрофорезе с pDNA, выделенной из таких штаммов, как DH10B, XL1-Blue.
п. 13, 18.
На этом этапе можно добавить в среду глицерин до 7.5-15% и хранить клетки при -20oС (а лучше при -70oС).
Селекция на Amp отбирает клетки, несущие pSK(-). Высев должен быть чрезвычайно неравномерным, т.к. обычно вырастает очень много колоний.
MolBiol.ru >
Методы >
Фаг лямбда > Вырезание плазмиды in vivo
Zbio-wiki
Дополнить