Экспресс-метод выделения pDNA

Комментарии Общие По пунктам  Дополнить

Очень удобный и быстрый метод, когда требуется быстро проанализировать наличие вставки в векторе, размер плазмиды и т.п.

Дополнения, комментарии, вопросы

Гость /31.10.2006 13:53/
A chto predstavljaet soboj SDS(+)-буфер?




Guest /31.10.2006 14:21/
какой такой?




DNAuser /02.11.2006 23:19/
У меня недавно времени не было для минипрепа, и наткнулся на даный метод. Хороший метод для быстрого анализа, к тому же отфенолил без SDS - получилось красиво, и вышеописанная проблема выскальзывания не возникла ни разу.




guest: Igor /15.02.2007 14:31/
Добрый день,
а какие минусы при экспресс методе? Можно ли использовать дальше для секвенирования полученную таким образом пДНК, разумеется после вырезания с агарозного геля?
Заранее спасибо.




curious67 /15.02.2007 16:09/
таким методом можно только относительно быстро проскринировать несколько десятков клонов на наличие вставки, более ни для чего такая "ДНК" не годится, разумеется. Но то же самое много быстрее и проще можно сделать ПЦРом прямо с колоний, несколько сотен за раз -не проблема. А потом что так, что эдак наращивать и выделять по-человечески, ПЦР культурнее и грязи меньше вокруг




guest: Igor /15.02.2007 22:37/
Большое спасибо за ответ!




би-олух /16.02.2007 17:09/
А если вместо Ф+Х взять просто хлороформ. По идее, ничего особенно не поменяется?




curious67 /16.02.2007 18:23/
только не все белки уйдут. Можно ыообще не фенолить, соотв. не хлороформить, для сиквенса и рестрикции аналитической сойдет и так, убрать соли 80% спиртом, и ладушки




би-олух /17.02.2007 10:49/
"только не все белки уйдут. Можно ыообще не фенолить, соотв. не хлороформить, для сиквенса и рестрикции аналитической сойдет и так, убрать соли 80% спиртом, и ладушки "

Спасибо!
Мне тоже так показалось.
Только, если совсем не фенолить, то надо аккура-атненько, а то гадость всякая будет плавать. А если с хлороформиком открутить, то вполне чистенько и быстренько получается.

Хотя, это, наверное, кто как привык




curious67 /17.02.2007 16:37/
хлороформ ничему не повредит, это точно. Хотя у меня и без него ничего не плавает- кручу 13400 об. 10 мин при комн. Т, это после нейтрализации, потом изопропиловый спирт и все. Не забывать промывать хорошенько 80% этанолом




Dzmitry /20.02.2007 17:14/
Поясните плиз этот момент

40µl Ф:Х - это фенол и хлороформ? В какой пропорции? Какие концентрации? Или что?




curious67 /20.02.2007 17:55/
во-первых, слово хлороформ нужно понимать как 24:1 хлороформ:изоамиловый спирт, это всегда так, смешиваете и забываете
Во-вторых, Ф:Х бывает по-разному, я люблю Х побольше, чтобы потом еще раз не добавлять чисто Х. Рутинно, я добавляю от 1/2 до 2/3 Ф к водному раствору, трясу до белой пены, после чего добавляется Х реально по вкусу, но поскольку так методики не пишутся, раза в 1.5 больше, чем Ф (по прописи 1:1,но с учетом трудности пипетирования Х из-за его текучести и быстрого испарения, Х попадает в пробирку меньше, чем Вы выставили на самплере). Вотб и снова яростно потрясти. Все. Счастье. Крутить по макс 3 мин




Dzmitry /20.02.2007 21:12/
Ясно. спасибо.




guest: al /21.02.2007 16:47/
(curious67 @ 20.02.2007 16:55)
  во-первых, слово хлороформ нужно понимать как 24:1 хлороформ:изоамиловый спирт, это всегда так, смешиваете и забываете



Ну, это классика, всегда так было.

Только вот мне давно очень любопытно - а для чего изоамиловый
нужен? Чем плох один хлороформ?
Может кто знает?




Guеst /21.02.2007 18:20/
(guest: al @ 21.02.2007 14:47)
  Чем плох один хлороформ?
Может кто знает?


пенится сильнее




curious67 /21.02.2007 18:21/
это просто- из курса коллоидной химии. Изоамил- ПАВ, который как все ПАВы, снижает поверхностное натяжение, поэтому фазы лучше разделяются. Литература по этому поводу будет интересная- не из PubMed-просто что-нибудь из Верна или Стивенсона- как китовый жир при шторме льют за борт




curious67 /21.02.2007 21:08/
(Guеst @ 21.02.2007 18:20)
  пенится сильнее


полная чушь- попробуйте вспеньте хлороформ!!!!!!!!




K6O6T613 /18.02.2008 17:46/
Один хлороформ при стоянии превращается во всякую гадость типа фосгена. Обычно добавляют 0.5% метанола для стабилизации или серебряную фольгу (для использования в оргюсинтезе или ЯМР соответственно). 1/25 часть изоамилового спирта в хлороформе также может оказывать стаб. действие...

Хотя идея, что изоамиловый спирт - это ПАВ, увлекающий белки в орг.фазу, мне нравится больше.




The problem /18.02.2008 21:29/
хлороформ превращается в фосген- утверждение сильное- на самом деле, фосген имеется в следовых количествах, и может чему-то там и вредит, но уж точно не ДНке.
Не берите в голову, Вам же им не дышать (надеюсь!), не траванетесь




Гость /16.04.2008 14:13/
а фенол сатурированый буфером или водой?




watchesonline89 /23.12.2022 12:17/
https://omegawatches89.mystrikingly.com/ ( https://omegawatches89.mystrikingly.com/ )
https://www.deviantart.com/omegawatches89/j...pular-930508248 ( https://www.deviantart.com/omegawatches89/journal/Reasons-Why-Replica-Watches-Are-So-Popular-930508248 )
https://eatsleepride.com/c/383270 ( https://eatsleepride.com/c/383270 )
https://fortunetelleroracle.com/fashion/ama...s-online-737627 ( https://fortunetelleroracle.com/fashion/amazing-offers-available-on-replica-watches-online-737627 )
https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89 ( https://www.intensedebate.com/people/omegawatches89 )
https://fortunetelleroracle.com/fashion-acc...-popular-737613 ( https://fortunetelleroracle.com/fashion-accessories/reasons-why-replica-watches-are-so-popular-737613 )
https://anotepad.com/notes/ykiydhnj ( https://anotepad.com/notes/ykiydhnj )
https://medium.com/@omegawatches89/amazing-...ne-b4863ed55af0 ( https://medium.com/@omegawatches89/amazing-offers-available-on-replica-watches-online-b4863ed55af0 )
https://omegawatches90.mystrikingly.com/ ( https://omegawatches90.mystrikingly.com/ )
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/repli...ve-items-online ( https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/replica-watches-find-high-quality-but-inexpensive-items-online )
https://62e8da780bf7c.site123.me/ ( https://62e8da780bf7c.site123.me/ )
https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71 ( https://padlet.com/omegawatches89/9ibenzfwbcer7k71 )
https://omegawatches89.simplesite.com/452939012 ( https://omegawatches89.simplesite.com/452939012 )
https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/excit...-replica-online ( https://62e8da780bf7c.site123.me/blog/exciting-deals-offered-on-latest-replica-online )
https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advan...replica-watches ( https://62e8ce2ae5d50.site123.me/blog/advantages-of-replica-watches )






--- страница форума с комментариями --