Исследованы молекулярная и функциональная организация в иерархии стволовых клеток и их потомков при миелодиспластическом синдроме. Показано, что источником пораженных клеток являются редкие предшественники с уникальным фенотипом. Возможно наиболее эффективная терапия будет связана с элиминацией таких предшественников.

Концепция раковых стволовых клеток (РСК) до сих пор не является бесспорной. Тем не менее, получены убедительные доказательства существования РСК при многих гематологических и сОлидных раках. Миелодиспластические синдромы (МДС) представляют собой нарушения созревания клеток крови, приводящие к несовершенному гематопоэзу часто прогрессирующему в острую миелоидную лейкемию. Для предотвращения этого заболевания требуется разработать средства, элиминирующие клоны, инициирующие МДС. Недавно показано, что МДС с делецией участка хромосомы 5q происходит от редких CD34+CD38- гематопоэтических стволовых клеток. Но не было показано, что они являются единственным предшественником МДС.

Авторы проследили наследование молекулярных и белковых маркеров от стволовых клеток к дифференцированным элементам крови (гранулоцитам-макрофагам, мегакариоцитам-предшественникам эритроидных клеток) при МДС. Показано, что способность поддерживать МДС-специфические клетки-потомки свойственна исключительно стволовым клеткам с фенотипом Lin^-CD34⁺CD38^-CD90⁺CD45RA^-. При трансплантации мышам только эти клетки, но не их потомки производили весь спектр клеток, свойственных МДС.

С помощью секвенирования экзонов авторы проследили “обратный путь” накопления мутаций в элементах крови по мере развития МДС и трансформации его в острую миелоидную лейкемию у нескольких пациентов. Во всех случаях этот путь вел к единой стволовой клетке- предшественнику.

Полученные результаты позволяют полагать, что наиболее эффективная терапия МДС, который в настоящее время лечится плохо, может быть направлена против редких клеток с фенотипом Lin^-CD34⁺CD38^-CD90⁺CD45RA^-. При других раках стволовые клетки могут быть не столь редкими. Но функциональная и молекулярная уникальность их может иметь важнейшее значение для реализации продолжающихся попыток идентифицировать их in vivo и использовать для мониторинга заболевания и как мишени для терапии. Элиминация стволовых раковых клеток представляется необходимой, а в принципе, возможно и достаточной для успешной терапии рака.


Источник: Woll PS et al. Myelodysplastic syndromes are propagated by rare and distinct human cancer stem cells in vivo. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 794-808.

Подпись к рисунку: Пораженные клетки при миелодиспластическом синдроме происходят от единого предшественника.

---

Поблагодарили (2): Danse, Vadim Sharov

Феномен фоторецепции хорошо изучен у различных представителей животных, в первую очередь у позвоночных. Однако опсин-зависимая фоторецепция известна и за пределами царства животных – например, у грибов (которые вместе с животными образуют суперкладу Opisthokonta). Недавно вышедшая статья бразильских и британских ученых посвящена грибу Blastocladiella emersonii (Blastocladiomycota). Этот организм был выбран потому, что в его жизненном цикле присутствует (в отличие от более широко известных аско- и базидиомицетов) фаза зооспоры. Подвижность зооспор обеспечивается жгутиками; важно, что они обладают положительным фототаксисом. Авторами был изучен молекулярный механизм фоторецепции Blastocladiella.

Напомним, что в фоторецепторах сетчатки глаза позвоночных свет вызывает изменение конформации родопсина, что активирует G-белок трансдуцин, который, в свою очередь, ингибирует фосфодиэстеразу – фермент, катализирующий гидролиз цикло-ГМФ (цГМФ) до ГМФ. Понижение внутриклеточного уровня цГМФ приводит к закрытию Na/Ca каналов и, соответственно, к гиперполяризации мембраны фоторецепторной клетки. Далее сигнал передается через синапс на нейрон. Кроме того, при активации данного каскада активируется гуанилат-циклаза, восстанавливая уровень цГМФ.

Так вот, выяснилось, что механизм фоторецепции Blastocladiella обладает рядом поразительных особенностей. При секвенировании генома был обнаружен ген, кодирующий необычный "слитой" ("fusion") белок, гибрид опсина и гуанилат-циклазы, названный BeGC1. Дальнейшие эксперименты подтвердили его участие в фоторецепции и регуляции фототаксиса. Так, при освещении светом в зооспорах резко возрастала концентрация цГМФ. "Выжигание" (фотообесцвечивание) родопсина, блокирование биосинтеза ретиналя, а также ингибирование гуанилат-циклазной активности приводило к подавлению фототаксиса. Изучение внутриклеточной локализации BeGC1 иммунохимическими методами выявило, что он находится в т.н. глазкАх (eyespots), рядом с основанием жгутика. Помимо BeGC1, в геноме был найден BeCNG1, ген, кодирующий цГМФ-зависимый калиевый канал. Исходя из ряда важных признаков, авторы предположили, что именно он является эффектором BeGC1-зависимого фототаксиса, напрямую регулируя биение жгутика. Примечательно, что гомологи BeGC1, в частности, регулируют хеморецепцию у сперматозоидов некоторых животных.

Таким образом, изученный механизм фоторецепции у гриба выявил как определенное сходство с таковым у животных (родопсин-подобный фоторецептор, цГМФ как посредник), так и удивительные отличия.

Так что, как говорится,

"А у нас в Рязани
Грибы с глазами:
Их едят,
А они глядят".


Картинка из рассматриваемой статьи
A – молекулярный механизм фоторецепции у позвоночных
B – молекулярный механизм фоторецепции у Blastocladiella emersonii
RhI, родопсин I типа; RhII, родопсин II типа; GC, гуанилат-циклаза; T, трансдуцин;
PDE, фосфодиэстераза; EM, мембрана глазков; PM, плазматическая мембрана; DM, мембрана дисков.

Источник: Avelar et al. A rhodopsin-guanylyl cyclase gene fusion functions in visual perception in a fungus. Curr Biol. 2014 Jun 2;24(11):1234-40. doi: 10.1016/j.cub.2014.04.009.
Статья в свободном доступе.

---

Поблагодарили (10): Vadim Sharov, ernesta88, AlexRez, Dashas, Serpent, LMP, NMR-guy, Acrimony, VasilijZlatogursky, Horse-radish

100 студентов и аспирантов прошли интенсивные курсы по биоинформатике

Первого августа состоялось закрытие Второй летней школы по биоинформатике, организованной Институтом биоинформатики, Санкт-Петербургским государственным университетом и Санкт-Петербургским Академическим университетом РАН.
В школе приняло участие 100 студентов, аспирантов и молодых ученых физико-математических, компьютерных и биологических специальностей, интересующихся биоинформатикой. В течение шести дней участники прослушали лекции и прошли интенсивные курсы от ведущих учёных-биоинформатиков, а также смогли поработать в командах над решением реальных научных задач.



На школе биологи освоили азы программирования и статистики, а технические специалисты расширили свои знания по молекулярной биологии и генетике. В результате участники познакомились с такими темами, как основы биоинформатики, новые методы анализа геномных и транскриптомных данных, системная биология, метагеномика, эпигеномика. Лекции и интенсивы провели сотрудники научных лабораторий и биотехнологических компаний Санкт-Петербурга и Москвы, а также иностранных
университетов, среди которых Елена Григоренко (Yale University), Алексей Кондрашов (University of Michigan, МГУ), Илья Серебрийский (Fox Chase Cancer Center), Филипп Хайтович (Shanghai Institutes for Biological Sciences, Сколковский институт науки и технологий).

Судя по отзывам участников, главные задачи школы – знакомство с областью биоинформатики и получение практических навыков – были успешно выполнены.
Благодаря лекциям студенты и аспиранты расширили свой кругозор, а участие в научных проектах позволило преодолеть страх перед практическими задачами и приобрести опыт даже тем, кто до школы не был знаком с биоинформатикой. Участники уехали уставшими, но вдохновлёнными:



Летняя школа биоинформатики проходит уже второй год. Студенты и аспиранты демонстрируют к ней стабильно высокий интерес: в 2013 году, при запуске проекта, было подано 403 заявки, в 2014 – уже 450.

В 2014 году школу поддерживают: JetBrains, BIOCAD и EMC, фонд Дмитрия Зимина «Династия», Российский фонд фундаментальных исследований, программа GameChangers. Два года подряд генеральным партнером школы является ОАО «РВК».



Все материалы школы будут выложены на сайте Института биоинформатики до конца осени.

реклама

Метод Гибсона позволяет успешно производить сборку множества фрагментов ДНК, невзирая на длину фрагментов и степень совместимости их концов друг с другом. Вскоре после первого применения метод Гибсона был адаптирован для нужд синтетической биологии. Сегодня методика широко применяется благодаря своей простоте, возможности применения для больших конструкций ДНК, и тому, что она легко подстраивается для любой конкретной задачи.

Предлагаемый набор позволяет эффективно сшивать большое количество фрагментов ДНК с перекрывающимися концами в одной изотермальной реакционной смеси (1, 2) и может быть реализован на практике при помощи продукта компании New England Biolabs под названием Gibson Assembly Master Mix (by Synthetic Genomics, Inc).

Реакционная смесь продукта включает в себя три различных энзиматических реактива, функционирование которых обеспечиваются единым буферным раствором:

1. 5’-экзонуклеаза удаляет основания с 5’- концов двуцепочечных фрагментов ДНК и создает одноцепочечные 3’-концы ДНК, которые гибридизуются во время постепенного охлаждения реакционной смеси, соединяя фрагменты друг с другом;
2. ДНК-полимераза закрывает пропуски внутри образовавшихся после отжига фрагментов;
3. ДНК-лигаза ковалентно сшивает фрагменты ДНК.

На рисунке представлена схема, которая лежит в основе методики. После охлаждения реакционной смеси получают непрерывные двухцепочечные фрагменты ДНК, которые могут быть использованы для ПЦР, циклической амплификации или в других биологических процессах, включая прямую трансформацию. Данный метод был использован группой Гибсона и другими для сборки олигонуклеотидов длиной до нескольких сотен тысяч п.о., обладавших длиной перекрывающихся фрагментов от 15 до 80 п.о. (1-3).

Основные преимущества Gibson Assembly Master Mix:

1. хорошие результаты при сшивании длинных фрагментов ДНК, а также большого количества фрагментов разной длины;
2. возможность использования для различных последовательностей ДНК, без необходимости специального проектирования сайтов клонирования;
3. сборка фрагментов без очистки реакционной смеси после ПЦР;
4. возможность осуществить сложную сборку фрагментов в течение 1 часа;
5. использование полученных сшитых фрагментов ДНК непосредственно для трансформации, или в качестве матрицы для ПЦР и амплификации по типу катящегося кольца;
6. простая адаптация к различным манипуляциям с ДНК, включая сайт-направленный мутагенез, вставки и делеции.

Дополнительную информацию о Gibson Assembly Master Mix можно найти в комментарии к этому сообщению, а также на следующих ресурсах: http://www.syntheticgenomics.com и http://www.jcvi.org

Gibson Assembly Master Mix можно ЗАКАЗАТЬ

Литература:
1.Gibson, D.G. et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases, 2009, Nature Methods, 6, 343-345.
2.Gibson, D.G. et al. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome, 2010, Nature Methods, 7, 901-903.
3.Gibson, D.G. Personal communication.

Охарактеризованы молекулярные механизмы функционирования деметилазы гистона Н3К4 JARID1B как онкогена при люминальном раке молочной железы. Полученные результаты могут быть полезны при разработке стратегии лечения этого заболевания. Но сложность спектра функций JARID1B требует более утонченного подхода, чем просто подавление ферментативной активности.

Метилирование гистонов играет важную роль не только в организации хроматина, но и в регуляции экспрессии генов. Систематическое исследование раковых геномов показало наличие множества нарушений в генах, ответственных за модификацию гистонов, но их роль в канцерогенезе и функциональное значение изучены недостаточно. Накоплено много данных о том, что метилтрансферазы и деметилазы гистонов играют ключевую роль в регулировке дифференцированного статуса клеток. Ген, кодирующий деметилазу лизина 4 гистона Н3 JARID1B был идентифицирован как реверсивно регулируемый сигнальным путем HER2 при раке молочной железы. Но, несмотря на важную роль JARID1B и в онтогенезе, и в канцерогенезе механизмы его функционирования изучены слабо.

Анализ культур клеток рака молочной железы показал, что увеличение количества копий гена и белка JARID1B коррелирует с увеличением количества транскриптов и белков, свойственных люминальному подтипу. В клетках и люминального, и базального рака подавление экспрессии JARID1B с помощью shРНК подавляло рост клеток, но в случаях люминального эффект был сильнее. При этом увеличивалось содержание метилированного гистона Н3, но не других гистонов. Подавление JARID1B с помощью siРНК приводило к накоплению или истощению множества транскриптов. Среди 200 генов, наиболее подверженных изменениям транскрипции, в люменальных клетках больше генов активировалось, чем подавлялось. В клетках базального рака наблюдалась обратная зависимость.

В результате подавления JARID1B с помощью siРНК происходило усиление экспрессии генов, связанных с базальным фенотипом, стволовыми клетками и компонентами сигнального пути TGFβ. Дальнейшие эксперименты показали, что экспрессия JARID1B требуется для подавления генов, свойственных базальному подтипу, а подавление его экспрессии ведет к торможению роста клеток. И наоборот, потеря функции JARID1B в клетках базального подтипа приводит к подавлению генов пути TGFβ, но это не обязательно связано с наблюдавшимся торможением роста.

Эксперименты по секвенированию участков генома, с которыми связывается JARID1B, по метилированию гистона Н3 и анализу профилей экспрессирующихся генов показали, что JARID1B преимущественно связывается с промоторами активных генов, обогащенных метилированным Н3. Но он не является сильным репрессором транскрипции, а скорее тонким регулятором метилирования гистона и уровня транскрипции. JARID1B играет ключевую роль в поддержании программы экспрессии генов, свойственных для люминального рака. Высокий уровень его экспрессии связан с негативным прогнозом течения заболевания.

Таким образом, детально охарактеризованы молекулярные механизмы функционирования деметилазы гистона Н3К4 JARID1B как онкогена при люминальном раке молочной железы. Полученные результаты могут быть полезны при разработке стратегии лечения этого заболевания. Но сложность спектра функций JARID1B требует более утонченного подхода, чем просто подавление ферментативной активности.


Рисунок: Продукт активного гена JARID1B подавляет экспрессию генов, связанных с базальным фенотипом, его блокирование приводит к подавлению роста клеток опухоли. В клетках базального фенотипа инактивация JARID1B активирует гены люминального фенотипа.

Источник: Yamamoto S, Wu Z, Russnes HG, Takagi S, Peluffo G, Vaske C, Zhao X, Moen Vollan HK, Maruyama R, Ekram MB, Sun H, Kim JH, Carver K, Zucca M, Feng J, Almendro V, Bessarabova M, Rueda OM, Nikolsky Y, Caldas C, Liu XS, Polyak K. JARID1B Is a Luminal Lineage-Driving Oncogene in Breast Cancer. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 762-777.

---

Поблагодарили (1): Vadim Sharov

Рак молочной железы “базального” фенотипа, в отличие от “люменального”, более агрессивен и плохо лечится. Показано, что важнейшую роль в регуляции механизмов транскрипции, поддерживающих “базальный” фенотип рака молочной железы, играет сумоилирование белка TFAP2А. Подавление сумоилирования может стать эффективной стратегией лечения базального рака.

Рак молочной железы – самое распространенное онкологическое заболевание женщин. Созданная в последнее время клиническая классификация его подтипов по профилю экспрессирующихся генов позволяет предсказывать исход заболевания и определять рациональную терапию. Но о механизмах регуляции транскрипции, определяющих эти подтипы, известно еще очень мало. Было известно, что функция TFAP2C - одного из генов семейства АР-2, чрезвычайно важна для поддержания люменального фенотипа рака, для индукции генов, свойственных этому фенотипу, и для репрессии генов, свойственных другому, более агрессивному базальному фенотипу. Несмотря на очень сильное сходство с TFAP2C, функции другого гена семейства TFAP2А сильно отличались. С целью получить важные данные для разработки стратегии создания противораковых средств авторы изучили функциональные различия белков TFAP2C и TFAP2А в регуляции “люменальных” генов.

В экспериментах на культурах клеток на уровне как мРНК, так и белков было показано, что выключение TFAP2C подавляет экспрессию “люменальных” генов, а выключение TFAP2А на нее практически не влияет. Активный ген TFAP2С подавлял экспрессию “базальных” генов, а TFAP2А на нее не действовал. В то же время анализ участков генома, с которыми связывались продукты этих двух генов показал их практическую идентичность. Следовательно, функциональные различия TFAP2C и TFAP2А не связаны с их взаимодействием с регуляторными областями генов-мишеней.

Эксперименты с гибридными белками, в которых отдельные участки TFAP2А замещались гомологичными участками TFAP2С показали, что область TFAP2С, ответственная за “люменальную” активацию, расположена в пределах первых 128 аминокислотных остатков. Блок активности TFAP2А на “люменальных” промоторах мог быть связан как с дополнительными коактиваторами, специфичными лишь для TFAP2С, так и с промотор-специфическими репрессорами TFAP2А. Проверка множества факторов, взаимодействующих с TFAP2C и TFAP2А показала, что активация TFAP2А на “люменальных” промоторах может быть достигнута путем инактивации двух генов, контролирующих путь присоединения к нему белков SUMO (small ubiquitin-like modifier). Замена K10R в TFAP2А также резко понижала уровень его сумоилирования и придавала способность активировать “люменальные” гены.

Выключение TFAP2C в культивируемых клетках придавало им “базальный” фенотип. Если же в них вводили TFAP2А-K10R, но не TFAP2А дикого типа, “люменальный” фенотип восстанавливался. Аналогичный эффект давало подавление сумоилирования специфическим ингибитором.

Обработка культур клеток базального рака ингибиторами сумоилирования перед введением их мышам подавляла образование опухолей. Более того, введение необработанных клеток на фоне “терапии” ингибиторами дало аналогичный результат. Токсического эффекта ингибиторов при этом не наблюдалось.

Таким образом показано, что сумоилирование играет важнейшую роль в регуляции механизмов транскрипции, поддерживающих “базальный” фенотип рака молочной железы. Подавление сумоилирования может стать эффективной стратегией лечения базального рака.


Рисунок: Сумоилирование белка TFAP2A требуется для поддержания высокоагрессивного базального фенотипа рака молочной железы. Блок сумоилирования придает опухоли менее агрессивный люменальный фенотип.

Источник: Bogachek MV, Chen Y, Kulak MV, Woodfield GW, Cyr AR, Park JM, Spanheimer PM, Li Y, Li T, Weigel RJ. Sumoylation pathway is required to maintain the basal breast cancer subtype. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 748-761.

---

Поблагодарили (2): LMP, Vadim Sharov

реклама

Дорогие друзья, любители микроскопии!

Приглашаем вас на сайт, посвященный Hi-End микроскопии Confocal club ( http://confocal-club.ru/ ) .

Ресурс адресован в первую очередь специалистам, работающим с современными конфокальными микроскопами и системами со сверхразрешением, он также будет интересен молодым ученым, студентам и аспирантам, которые видят свое профессиональное развитие в области биоимиджинга и всем, кто интересуется передовыми технологиями микроскопии.

Лазерная сканирующая микроскопия в последние годы из уникального метода исследования, доступного узкому кругу специалистов, превратилась в широко распространенную методику для изучения живого микромира. Растет число пользователей конфокальных лазерных сканирующих микроскопов в научных центрах, институтах и университетах. В то же время, многие специалисты сталкиваются с вопросами при выборе метода пробоподготовки, окраски, постановки и проведения эксперимента, а стремительное развитие технологий с каждым днем открывает новые возможности для исследования биологических объектов. Сайт Клуба конфокалистов — это информационная платформа для обмена опытом, дискуссий, обсуждения инструментов и методов биоимиджинга, консультаций с экспертами и пользователями микроскопов.

Сайт Клуба конфокалистов организован по принципу активного участия зарегистрированных пользователей в информационном наполнении ресурса. На портале существует возможность создавать свой профиль, публиковать изображения и видео, полученные на приборах, делиться новостями и мероприятиями, размещать материалы для обсуждения, а также обмениваться интересными ссылками. Живое общение организовано на базе группы Клуба в профессиональной сети LinkedIn.

Ждем Вас на сайте Confocal club ( http://confocal-club.ru/ ) и на страницах форума в профессиональной сети LinkedIn для участия в плодотворных дискуссиях!

Предложение о создании русскоязычного ресурса для специалистов в области биоимиджинга впервые прозвучало на первой встрече Клуба конфокалистов в Новосибирске. Клуб конфокалистов — это сообщество экспертов, объединенных идеей развития базы знаний по конфокальной микроскопии, повышения доступности парка имеющегося в России оборудования широкому кругу ученых. Среди инициатив Клуба — организация регулярных лекций, семинаров и мастер-классов по конфокальной микроскопии в ведущих научных и учебных заведениях по всей России, при поддержке Клуба на регулярной основе проводится Школа по конфокальной микроскопии.

---

Поблагодарили (3): Vadim Sharov, Anya2010, Nik-AD

Описан новый механизм, создающий барьер для проникновения Т-клеток в опухоли. В сосудах раковых опухолей, но не в нормальных тканях, экспрессируется FasL - лиганд медиатора гибели клеток. В результате происходит селективное поражение эффекторных, но не регуляторных Т-клеток, что приводит к подавлению иммунного ответа на опухоль. Комбинированное воздействие на FasL и на факторы опухоли, индуцирующие продукцию FasL, может стать эффективной стратегией терапии рака.

Эффективность иммунного ответа на рак в значительной мере зависит от способности противоопухолевых Т-клеток проникать к опухоли. Высокий уровень инфильтрации ими опухоли существенно повышает выживаемость больных. Опухоль же использует ряд протективных программ для уклонения от иммунного ответа и усиленного ангиогенеза. Было показано, что факторы, контролирующие ангиогенез, осуществляют и ряд других функций. В частности, они организуют барьер, ограничивающий инфильтрацию Т-клетками. Есть данные, что эндотелий действует как селективный барьер, позволяющий некоторым Т-клеткам, в частности Т-регуляторам (T_reg), проникать более эффективно. Но эта дифференциальная регуляторная роль эндотелия ранее не исследовалась.

Авторы обратили внимание на белок FasL, который действует как медиатор при апоптозе Т-клеток и о котором было известно, что он экспессируется в эндотелии опухолей человека и мыши. Иммуногистохимическое исследование более 600 опухолей шести типов рака и соответствующих нормальных тканей показало, что FasL не определяется в нормальных тканях, но экспрессируется в кровеносных сосудах первичных опухолей и метастазов. При совместном культивировании клеток эндотелия из раковых опухолей яичников с активированными Т-лимфоцитами, ассоциированными с опухолью наблюдалась гибель Т-лимфоцитов. Антитела, блокирующие FasL, ослабляли этот эффект.

Для эффективного противоопухолевого действия требуется правильный баланс в опухолях Т-эффектора (Т_eff) и Т-регулятора (T_reg). Эксперименты с культивируемыми клетками показали, что эндотелиальный FasL не действует на неактивированные Т-клетки. В то же время он активно подавляет Т_eff, но не T_reg. В раковых опухолях наблюдался дисбаланс этих клеток с резким сдвигом в пользу T_reg. Таким образом, активация экспрессии FasL в клетках эндотелия в опухоли селективно элиминирует клетки Т_eff, что приводит к накоплению в опухолях T_reg с которым связана устойчивость к иммунному ответу.

Локальная экспрессия эндотелиального FasL позволяет предположить регулировку локальными факторами. Обработка культивируемых клеток эндотелия асцитной жидкостью 20 раковых опухолей яичников, содержащей растворимые факторы опухоли, примерно в половине случаев вызывала индукцию FasL. Также примерно половина из супернатантов 13 клеточных линий рака яичников обладали аналогичными свойствами. При этом, если клетки культивировали в гипоксических условиях эффект проявлялся сильнее. Ряд проверенных опухолевых факторов индивидуально не индуцировал FasL. Но интерлейкин-10 и простагландин Е₂ таким свойством обладали, и индукция усиливалась при добавлении VEGF-A (фактор роста васкулярного эпителия А). Комбинация этих трех факторов обладала еще более сильным действием. VEGF-A как таковой не достаточен и не является необходимым для индукции FasL, но его присутствие резко усиливало продукцию.

Анализ опухолей рака яичников показал, что в большинстве из них усиленно экспрессируются VEGF-A и СОХ1 (циклооксигеназа 1), которые могут регулировать экспрессию FasL. Это предположение было проверено на мышиных моделях, имитирующих несколько раков человека. Комбинированное введение антител против Vegf-a и ингибитора Сох1 ацетилсалициловой кислоты, других ингибиторов этих факторов резко снижало уровень FasL в сосудах опухолей и подавляло рост опухолей. На мышах также было показано, что экспрессия FasL сдвигает в опухолях соотношение Т_eff/T_reg в сторону T_reg, а обработка ингибиторами Vegf-a и Сох1 восстанавливало инфильтрацию опухолей Т_eff. Ингибиторы этих факторов, как и ингибитор простагландина, замедляли рост опухолей и продлевали выживаемость мышей.

Показанная в результате исследования тесная связь механизмов ангиогенеза и иммуносупрессии, множество факторов и путей, контролирующих эти процессы, позволяют предположить, что наиболее эффективной стратегией терапии рака будет комбинированное воздействие на механизмы обоих процессов.


Источник: Motz GT, Santoro SP, Wang LP, Garrabrant T, Lastra RR, Hagemann IS, Lal P, Feldman MD, Benencia F, Coukos G. Tumor endothelium FasL establishes a selective immune barrier promoting tolerance in tumors. // Nat Med. 2014; V. 20: P. 607-615.

Подпись к рисунку: Схема сигнального пути Fas.

---

Поблагодарили (1): Vadim Sharov

В опухолях аденоскваматозной карциномы поджелудочной железы обнаружены мутации гена UPF1, инактивирующие комплекс деградации неправильно сплайсированных мРНК. Дефект этого комплекса в случае раковых опухолей показан впервые. Детекция мутаций может позволить усовершенствовать диагностику аденоскваматозной карциномы, а субстраты комплекса в принципе могут стать мишенями для разработки новых методов терапии рака.

Аденоскваматозная карцинома поджелудочной железы (АСК) – чрезвычайно агрессивная и часто метастазирующая опухоль, превосходящая по этим свойствам даже аденокарциному. Ее генетика была слабо изучена. В опухолях АСК были найдены мутации генов KRAS и TP53, свойственные опухолям других форм рака поджелудочной железы, но никаких мутаций, специфических для АСК.

Авторы обнаружили, что в опухолях АСК с аллелем ТР53 дикого типа присутствует мРНК р53 аномального размера, отсутствующая в нормальной ткани. Секвенирование показало, что она представляет собой продукт альтернативного сплайсинга с использованием неканонических донора сплайсинга в интроне 6 и акцептора в интроне 10. В результате появлялся терминирующий кодон, прерывающий синтез р53. Аномальная мРНК обнаруживалась только в опухоли, но не в окружающей ткани, а нормальная мРНК р53 в обеих тканях. В норме мРНК с кодонами досрочной терминации трансляции деградируются комплексом NMD (nonsense- mediated RNA decay). Авторы предположили, что в опухолях АСК нарушен этот комплекс. Прямое секвенирование показало, что в опухолях 18 из 23 больных АСК имеются мутации в гене UPF1. В других генах комплекса NMD – UPF2, UPF3А, UPF3В - мутаций не найдено. Мутации UPF1 не обнаружены в не-АСК панкреатических опухолях и в опухолях скваматозной карциномы легких.

Все найденные мутации сосредоточены в экзонах и интронах двух областей гена UPF1. Локализация мутаций позволила предположить, что многие из них нарушая структуру экзонных и интронных энхансеров сплайсинга блокируют нормальный сплайсинг мРНК UPF1. Для проверки предположения были сконструированы мини-гены, содержащие последовательности обоих мутирующих участков UPF1. Введение в них мутаций, найденных у 15 пациентов, приводило к аномальному сплайсингу мРНК в соотношении 10:1 и более по сравнению с нормальным сплайсингом. При этом элиминировались части одного из двух доменов, необходимых для нормального функционирования UPF1.

В соответствии с этими результатами показано, что в опухолях АСК, в отличие от окружающей ткани, снижено содержание или вообще отсутствует белок UPF1 и накапливаются субстраты NMD. В случае АСК дефект NMD сдвигает баланс между нормально и аномально сплайсированными мРНК, что, вероятно, приводит к усилению малигнизации. Обнаружение в опухолях АСК мутаций в комплексе NMD впервые показало участие дефектов NMD в онкогенезе. Детекция этих мутаций может позволить усовершенствовать диагностику АСК, а субстраты NMD в принципе могут стать мишенями для разработки новых методов терапии рака.


Источник: Liu C, Karam R, Zhou Y, Su F, Ji Y, Li G, Xu G, Lu L, Wang C, Song M, Zhu J, Wang Y, Zhao Y, Foo WC, Zuo M, Valasek MA, Javle M, Wilkinson MF, Lu Y. The UPF1 RNA surveillance gene is commonly mutated in pancreatic adenosquamous carcinoma. // Nat Med. 2014; V. 20: P. 596-598.

Подпись к рисунку: Локализация мутаций, обнаруженных в гене UPF1 при аденоскваматозной карциноме поджелудочной железы.

---

Поблагодарили (2): Danse, Vadim Sharov

Разработан очень чувствительный комплекс анализа опухолевой ДНК, циркулирующей в крови. Основные этапы методики – отбор только тех участков генома, где ожидаются аномалии, и их прочитывание несколько тысяч раз. Высокая чувствительность, информативность метода и его сравнительно невысокая стоимость позволяют рекомендовать метод в клиническую практику для диагностики и мониторинга различных раков.

Опухолевая ДНК, циркулирующая в кровотоке (circulating tumor DNA – ctДНК ), представляет собой многообещающий биомаркер для диагностики и оценки состояния раковых опухолей. Но разработанные до сих пор методы недостаточно чувствительны и не применимы ко всем пациентам, что препятствует их использованию в рутинной клинической практике.

Авторы разработали новую стратегию анализа ctДНК , названную CAPP-Seq (cancer personalized profiling by deep sequencing). Разработка проведена на модели немелкоклеточной карциномы легких (NSCLC), но может быть адаптирована ко многим другим ракам. Прежде всего, была модифицирована методика приготовления проб для секвенирования из малых количеств ДНК. Ключевым элементом модификации была разработка “селектора” - набора биотинилированных олигонуклеотидов, соответствующих участкам ДНК, в которых локализованы “повторяющиеся” аномалии, обнаруженные у многих пациентов с NSCLC или аномалии, подозреваемые на ассоциацию с этим раком. Для этого были использованы базы данных по мутациям, обнаруженных в нескольких тысячах опухолей. Селектор перекрывает 521 экзон и 13 интронов 139 повторно мутировавших генов. Судя по опубликованным данным, в анализируемых участках локализованы мутации >95% случаев NSCLC. Этот набор перекрывает лишь 0,004% генома, что радикально облегчает анализ. С помощью селектора выделены, а затем амплифицированы соответствующие участки ДНК, полученной из плазмы крови.

Сравнительно небольшой набор фрагментов ДНК, подлежащий анализу с помощью секвенирования нового поколения позволил провести “сверхглубокое” секвенирование нуклеотидных последовательностей с повторностью прочитывания каждого участка в среднем ~5000 раз. Для получения результата было достаточно ~4 нг исходной ДНК из плазмы.

Сt ДНК обнаруживалась в 100% случаев NSCLC на стадиях II-IV и в 50% на стадии I. Многократное прочитывание обеспечивало распознавание мутантных аллелей даже когда их доля не превышала ~0,02%.

Метод позволяет не только обнаруживать мутации, но и прослеживать состояние опухоли. Можно оценивать результаты терапии, при которых уменьшение размера опухоли приводит к уменьшению доли опухолевых аллелей в ctДНК. Результаты анализа ctДНК подтверждаются данными компьютерной томографии. Более того, анализ ctДНК оказался более чувствительным, чем компьютерная томография.

Полученные результаты показывают, что CAPP-Seq позволил провести сравнительно недорогой неинвазивный анализ ctДНК в подавляющем большинстве случаев NSCLC. Он может рутинно применяться в клинической практике и потенциально может ускорить персонализированную диагностику, выбор терапии и прослеживание результатов лечения рака. Кроме плазмы крови CAPP-Seq может быть применен для детекции раковой ДНК в других биологических пробах даже с низким содержанием раковых клеток и их ДНК.


Источник: Newman AM, Bratman SV, To J, Wynne JF, Eclov NC, Modlin LA, Liu CL, Neal JW, Wakelee HA, Merritt RE, Shrager JB, Loo BW Jr, Alizadeh AA, Diehn M. An ultrasensitive method for quantitating circulating tumor DNA with broad patient coverage. // Nat Med. 2014; V. 20: P. 548-554.

Подпись к рисунку: Принцип формирования селектора для CAPP-Seq и применение метода для анализа ctДНК.

---

Поблагодарили (15): ship, Pharmaсol, semi, Bear, Julchik, Vadim Sharov, isotope, haurhot, Olezhek, impartial, Leysan, LMP, Danse, NMR-guy, Пасюк

Сложилось мнение, что строма опухоли способствует росту и инвазии раковых клеток, подавляет иммунный ответ на опухоль и действие химиотерапевтических препаратов. Однако оказалось, что нарушение формирования стромы дуктальных карцином поджелудочной железы у модельных мышей путем блокирования сигнального пути Hedgehog приводит к развитию более агрессивных опухолей.

Для панкреатической дуктальной аденокарциномы (PDAC) характерно наличие развитой стромы, состоящей из активированных фибробластов, лейкоцитов и экстраклеточного матрикса. Недавно было показано, что элементы стромы могут стимулировать рост и инвазию клеток злокачественной опухоли, подавлять иммунный ответ на опухоль. Начаты разработки “противостромных” средств для терапии рака.

Показано, что при многих сОлидных раках в формировании стромы активно участвует сигнальный путь Hedgehog (Hh). В нормальной поджелудочной железе этот путь не работает, но активируется при воспалении и неоплазии. Лиганд этого пути (Shh) и весь путь активируются в пренеопластических участках и при дальнейшей прогрессии PDAC способствуя росту стромы.

В данной работе авторы исследовали роль опухолевой стромы на моделирующих PDAC мышах путем адресного для эпителия поджелудочной железы генетического или фармакологического подавления сигнального пути Hh в строме. Предполагалось, что вследствие важной роли, которую Shh играет важную роль в развитии стромы, его делеция должна повлиять на развитие опухолей. Делеция Shh приводила к частичной деградации стромы и изменению ее состава. Однако оказалось, что панкреатические опухоли образуются и при наличии гена, и в его отсутствие. Более того, при делеции опухоли развивались быстрее и продолжительность жизни животных была меньше. Частота образования метастазов существенно увеличивалась. Наблюдалась более сильная экспрессия генов, связанных с эпителиально-мезнехимальной транзицией. Гистологическое исследование опухолей показало значительно бОльшую степень злокачественности.

В результате исследования по подавлению компонентов сигнального пути Hh с помощью фармакологических препаратов авторы пересмотрели сделанные ими ранее выводы. Подавление функции Hh с помощью химического ингибитора IPI-926 приводило к таким же последствиям, как делеция Shh. Кратковременный положительный эффект комбинации IPI-926+ гемцитабин на ранних стадиях прогрессии PDAC, вероятно, был связан с генотоксическим эффектом и в итоге не влияет на развитие опухоли.

Малодифференцированные опухоли PDAC, формирующиеся вследствие делеции Shh или действия IPI-926, имеют сильно развитую сеть кровеносных сосудов. Ингибитор рецептора фактора роста кровеносных сосудов VEGFR практически не влиял на рост опухоли и выживаемость контрольных PDAC-мышей, но заметно увеличивал продолжительность жизни при делеции Shh или действии IPI-926. При этом наблюдалась частичная деградация опухоли. Анализ опухолей PDAC человека показал, что в них степень дифференцировки раковых клеток так же коррелируется с плотностью сети кровеносных сосудов и состоянием стромы, как у модельных мышей. В связи с этим следует рассмотреть возможность проведения направленной против ангиогенеза терапии для лечения больных со слабо дифференцированными и сильно васкуляризированными опухолями PDAC.


Источник: Rhim AD, Oberstein PE, Thomas DH, Mirek ET, Palermo CF(3), Sastra SA, Dekleva EN, Saunders T, Becerra CP, Tattersall IW, Westphalen CB, Kitajewski J, Fernandez-Barrena MG, Fernandez-Zapico ME, Iacobuzio-Donahue C, Olive KP, Stanger BZ. Stromal elements act to restrain, rather than support, pancreatic ductal adenocarcinoma. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 735-747.

Подпись к рисунку: Схема модели мыши ShhPKCY использованной в работе. Делеции, индуцируемые Cre в эпителии поджелудочной железы, активируют Kras, удаляют аллель р53 и оба аллеля Shh, активируют YFP.

---

Поблагодарили (2): Anya2010, Vadim Sharov

реклама


Fluent™ - новое решение для автоматизации в лабораторииКомпания Tecan представляет Вашему вниманию совершенно новую линейку роботизированных станций Fluent™ (Швейцария) для автоматизации лабораторных исследований. Благодаря широкому диапазону возможностей, специально разработанных для увеличения производительности клеточных и биохимических анализов, Fluent™ повышает пропускную способность, рационализирует рабочие процессы и обеспечивает более точные и надежные результаты.

① Больше функциональности в меньшем объеме. Запатентованная система Dynamic Deck позволяет Вам легко настраивать и перенастраивать пространство как над, так и под рабочим столом Fluent™, не изменяя габаритные размеры станции.
② Простота и доступность для оператора. Каждый Fluent™ поставляется со встроенным сенсорным экраном с интуитивно понятным интерфейсом, который обеспечивает простой запуск и согласованную работу системы.
③ Производительность в центре внимания. Манипуляторы Fluent™ перемещаются быстрее чем когда-либо благодаря функции Path Finder, оптимизирующей траекторию движения. Они работают параллельно и независимо друг от друга, максимально ускоряя получение результата
④ Встраивание оборудования для полной автоматизации рабочего процесса. Fluent™ представляет широчайшие возможности автоматизации лабораторных исследований. Все участвующие в рабочем процессе устройства можно интегрировать в систему благодаря большому количеству адаптеров. Программное обеспечение FluentControl, подобно дирижеру в оркестре объединяет все устройства и манипуляторы в единое целое.

Источник информации: http://www.tecan.com/fluent/


Более подробно узнать о Fluent™ можно у специалистов компании ООО «ТДА-Восток» (официального дистрибьютора TECAN).
Тел.: +7-495-380-36-64
E-mail: info@tda-vostok.ru



Новость 08.09.2014

3D-культуры клеток, «бросающие вызов» гравитации



Методы культивирования клеток и тканей используются исследователями уже более 100 лет. Начавшись с попыток культивирования куриных эмбрионов в физрастворе, они прошли много этапов в своём развитии. В XXI веке на первый план среди культуральных методов выходят 3D-культуры клеток, которые позволяют повысить жизнеспособность клеток и получать результаты с большей физиологической значимостью, чем традиционные монослойные культуры.

Условно способы культивирования клеток в трёх измерениях делят на каркасные (scaffold-based) и бескаркасные (scaffold-free). Каркасные подходы основаны на использовании различных трёхмерных структур, создаваемых на поверхности лабораторного пластика. Эти структуры могут представлять собой сшитые полимеры природного (коллаген, ламинин) или неприродного (полистирол, гидрогель, нанотрубки) происхождения. После посева клетки постепенно прорастают внутрь таких матриц, образуя тем самым тканеподобную 3D-культуру.

Альтернативой каркасным методам 3D-культивирования являются бескаркасные подходы, в которых для сбора клеток в трёхмерную микроткань используются, как правило, сила тяжести или микрофлюидные устройства. Так, швейцарская компания InSphero AG, расположенная в городе Шлирен неподалёку от Цюриха, использует метод висящей капли для получения микросфер из клеток. Принцип метода заключается в следующем. В лунки специального 96- или 384-луночного планшета GravityPLUS™ вносится суспензия клеток в питательной среде, которая образует висящую каплю, удерживаемую в узком отверстии лунок планшета за счёт капиллярных сил. Под действием силы тяжести клетки оседают в нижнюю часть капли и постепенно образуют межклеточные контакты, одновременно пролиферируя. Через 2-4 дня инкубации образуется микросфера из клеток диаметром 50-100 мкм, представляющая собой микроткань. Эти микросферы затем легко можно переместить из планшета GravityPLUS™ в планшет GravityTRAP™, имеющий лунки конической формы и дно диаметром 1 мм, в которое и попадает микросфера из клеток. Находясь в таком планшете, микросферы из клеток могут быть измерены в микропланшетном ридере, имеющем придонную оптику.

Компании InSphero и Tecan совместно продемонстрировали, что микропланшетный ридер Infinite M200 PRO идеально подходит для измерений микросфер, находящихся в планшете GravityTRAP™. Размер светового пучка модуля придонной флуоресценции Infinite 200 PRO прекрасно соответствует размеру конической лунки планшета, что позволяет считать лунку за один раз и обойтись без ее сканирования. А несколько режимов измерения позволяют экспериментаторам использовать все современные технологии считывания аналитического сигнала, включая светопоглощение, флуоресценцию и люминесценцию.

Таким образом, 3D-культуры клеток, находясь на переднем крае развития культуральных методов, уже сейчас могут использоваться в исследованиях механизмов рака, токсикологических и других исследованиях, а также в высокопроизводительном биоскрининге с целью поиска новых лекарств.

Чтобы узнать больше о продуктах компании InSphero, посетите сайт http://www.insphero.com
Чтобы узнать больше о ридерах Infinite 200 PRO, посетите сайт http://www.tecan.com/infinite200pro
Чтобы узнать больше о решениях Tecan для 3D-культур клеток, посетите сайт http://www.tecan.com/3dcellculture
Подготовлено по материалам Tecan Journal, Edition 02/2013

---

Поблагодарили (1): Anya2010

Описан механизм подавления апоптоза индуцированного повреждениями ДНК при гематологических раках. В отличие от эпителиальных раков, при которых этот процесс блокируется вследствие инактивации р53, в данном случае он связан с дефицитом необходимого для активации апоптоза эффектора пути Hippo YAP1. Инактивация киназы STK4, блокирующей экспрессию YAP1, представляется перспективным путем лечения гематологических раков.

В раковых и предраковых эпителиальных клетках в ответ на возникновение двунитевых разрывов ДНК и вызванную ими нестабильность генома активируется защитная система, запускающая апоптоз. Но эта система не может быть включена, если поврежден супрессор опухолей р53. При гематологических раках функциональные последствия повреждений ДНК и механизмы, подавляющие апоптоз изучены недостаточно. Кроме того, инактивация р53 при таких раках происходит достаточно редко.

В культивируемых клетках множественной миеломы (ММ) и в клетках, полученных от больных, несмотря на наличие сильных повреждений ДНК существенной гибели клеток не происходило. Следовательно, в клетках ММ имеется механизм, позволяющий им защититься от апоптоза, индуцируемого в нормальных клетках. Сравнение распределения ряда белков в клетках ММ, несущих мутации в ТР53, в ММ не имеющих таких мутаций и в нормальных клетках показали, что инактивация р53 в отличие от эпителия не играет существенной роли в развитии неоплазии гематопоэтических клеток. Альтернативный путь апоптозного ответа в них связан с переходом в ядро белка ABL1. Обработка ингибитором киназной активности ABL1 увеличивала жизнеспособность клеток. Следовательно, киназная активность ядерного ABL1 необходима для индукции апоптоза.

ABL1 формирует комплекс с р73 (гомологом р53) и эффектором пути Hippo YAP1. Известно, что в ответ на повреждение ДНК ABL1 индуцирует апоптоз фосфорилируя YAP1, который стабилизирует р73 и вместе с ним активирует проапоптозные гены. При ряде эпителиальных раков YAP1 проявляет себя как онкоген. Однако анализ опубликованных данных показал, что если экспрессия YAP1 в линиях клеток эпителиальных раков усилена, при гематологических раках она, как правило, резко подавлена. У больных ММ с низким уровнем YAP1 продолжительность жизни оказалась сильно сниженной.

Эксперименты по введению в культуры клеток ММ с делецией гена YAP1 активно экспрессирующегося гена показали, что это приводит к апоптозу и существенному уменьшению количества клеток. И наоборот, подавление YAP1 специфическими shРНК усиливало пролиферацию и выживаемость клеток. Вследствие функционального взаимодействия YAP1 и р73, экспрессия YAP1 сильно повышала уровень белка р73, хотя и весьма умеренно, стимулировала синтез его мРНК. Соответственно, усиливалась экспрессия генов, которые р73 регулирует как фактор транскрипции. В общем полученные результаты свидетельствуют, что апоптоз в клетках ММ индуцированный повреждениями ДНК и экспрессией YAP1, происходит путем усиления функции р73 и активации контролируемых им проапоптозных генов.

Было известно, что серин-треониновая киназа STK4 сильно снижает уровень YAP1 в клетке. Эксперименты по подавлению STK4 с помощью shРНК показали резкое усиление синтеза YAP1 как на уровне белка, так и мРНК. При этом существенно подавлялась пролиферация клеток и резко активизировался апоптоз. В клетках ММ с делецией YAP1 таких явлений не наблюдалось. Мутантная STK4, лишенная киназной активности, экспрессию YAP1 не подавляла. Эксперименты на мышах показали, что при введении им клеток ММ без подавления STK4 опухоли развивались, но если в них STK4 была подавлена, опухолей не наблюдалось. Таким образом, подавление STK4 активирует YAP1 и запускает каскад апоптоза как in vitro, так и in vivo.

Проверка набора линий клеток лимфомы и лейкемии показала, что так же, как при ММ во многих из них происходит повреждение ДНК, ABL1 локализован в ядре, а экспрессия YAP1 как на уровне белка, так и мРНК весьма низкая. И так же, как при ММ, низкое содержание YAP1 коррелировалось с негативным прогнозом у больных. Введение в клетки активно экспрессирующегося YAP1 приводило к активации генов, контролируемых р73, к апоптозу и уменьшению количества клеток.

С точки зрения клинической практики STK4 представляется многообещающей мишенью для лечения гематологических раков, характеризующихся повреждением ДНК и низким уровнем YAP1. Более того, выключение STK4 индуцирует апоптоз и в клетках, несущих мутантный ТР53. Поэтому восстановление уровня YAP1 также может быть эффективно для лечения опухолей с инактивированным Р53 и негативным прогнозом.


Источник: Cottini F, Hideshima T, Xu C, Sattler M, Dori M, Agnelli L, Ten Hacken E, Bertilaccio MT, Antonini E, Neri A, Ponzoni M, Marcatti M, Richardson PG, Carrasco R, Kimmelman AC, Wong KK, Caligaris-Cappio F, Blandino G, Kuehl WM, Anderson KC, Tonon G. Rescue of Hippo coactivator YAP1 triggers DNA damage-induced apoptosis in hematological cancers. // Nat Med. 2014; V. 20: P. 599-606.

Подпись к рисунку: Модель взаимодействия ABL1-YAP1-p73 и влияния подавления STK4 на уровень YAP1 при множественной миеломе.

---

Поблагодарили (4): Vadim Sharov, LMP, haurhot, Пасюк

Подавление миофибробластов стромы панкреатической дуктальной аденокарциномы повышает агрессивность опухоли, и использовать их в качестве мишени для терапии следует с осторожностью. Но истощение фибробластов в комбинации с анти-CTLA-4 иммунотерапией благоприятно влияет на опухоль и продлевает жизнь животных. Возможно это поможет при разработке новых подходов к терапии.

Панкреатическая дуктальная аденокарцинома (PDAC) практически всегда летальна, и средний период выживаемости пациентов составляет лишь 4-6 месяцев. Традиционная химиотерапия как правило желаемого эффекта не дает. Недавно показано, что фиброзная строма, формируемая многими солидными опухолями, в том числе PDAC, препятствует проникновению и действию на опухоль химиотерапевтических агентов. Практически единственным путем поиска эффективных путей воздействия на строму являются эксперименты на соответствующих модельных мышах, полученных с помощью методов генетической инженерии.

Истощение стромы путем блокирования паракринного сигнального пути Hedgehog дало обнадеживающие результаты: оно облегчает доступ лекарств к опухоли. Но эксперименты по блокированию миофибробластов стромы дали обескураживающий результат: наблюдалось ускорение прогрессии PDAC. Это требует детального исследования вклада стромы в процессы инициации и прогрессии PDAC, в частности функциональной роли αSMA⁺ миофибробластов и коллагена типа I.

На модельных мышах, воспроизводящих PDAC человека и позволяющих селективно подавлять полиферацию αSMA⁺ миофибробластов авторы показали, что истощение фибробластов стромы как на стадии уже сформировавшейся опухоли, так и на стадии предшественника PDAC – панкреатической интраэпителиальной неоплазии приводит к развитию более инвазивных недифференцированных и некротизированных опухолей, чем опухоли, возникающие без истощения. Продолжительность жизни животных существенно сокращалась. Иммуногистохимическое исследование опухолей, удаленных у пациентов с PDAC показало, что продолжительность жизни больных с низким содержанием αSMA была достоверно ниже, чем у больных с высоким содержанием, опухоли были слабее дифференцированы.

Истощение миофибробластов в строме опухолей мышей сопровождалось уменьшением содержания коллагена типа I и нарушением структуры экстраклеточного матрикса. Подавлялся ангиогенез, усиливалась гипоксия опухолей, включалась программа эпителиально-мезенхимальной транзиции, и многие раковые клетки экспрессировали антигены, свойственные стволовым раковым клеткам. Ранее на другой мышиной модели PDAC было показано, что истощение стромы вследствие блокирования сигнального пути Hedgehog повышает чувствительность опухолей к химиотерапевтическим средствам. В данном же случае, несмотря на уменьшение количества миофибробластов и коллагена, гемцитабин не влиял на развитие опухоли и продолжительность жизни животных.

Профайлинг экспрессирующихся генов у мышей при истощении миофибробластов показал существенные изменения экспрессии генов, связанных с иммунным ответом на опухоль. На ранних стадиях (панкреатическая интраэпителиальная неоплазия) существенно уменьшалась инфильтрация опухоли CD45⁺ и CD3⁺ Т-клетками, CD19⁺ В-клетками. И на ранних, и на более поздних стадиях развития PDAC уменьшалась доля Т-клеток эффекторов (Teff, CD4⁺Foxp3^-) по отношению к Т-регуляторам (Treg, CD4⁺Foxp3⁺). Уменьшенное соотношение Teff/Treg было связано с усиленной экспрессией поверхностного антигена цитотоксичных лимфоцитов CTLA-4. Введение мышам антител против CTLA-4 в комбинации с истощением стромы продлевало их жизнь на 60%. При этом опухолевая ткань частично замещалась нормальной паренхимой, уменьшалось содержание недифференцированных клеток в опухоли. На молекулярном уровне восстанавливалось соотношение Teff/Treg, профиль экспрессии генов приближался к профилю опухолей с неистощенной стромой.


Источник: Ozdemir BC, Pentcheva-Hoang T, Carstens JL, Zheng X, Wu CC, Simpson TR, Laklai H, Sugimoto H, Kahlert C, Novitskiy SV, De Jesus-Acosta A, Sharma P, Heidari P, Mahmood U, Chin L, Moses HL, Weaver VM, Maitra A, Allison JP, LeBleu VS, Kalluri R. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 719-734.

Подпись к рисунку: Выживаемость больных PDAC с высоким и низким уровнем αSMA в строме опухоли.

---

Поблагодарили (3): NCP-bio, Vadim Sharov, Anya2010

Для инициации и прогрессии ранних стадий рака поджелудочной железы требуется продукция Т-клетками CD4⁺ и γδT интерлейкина-17 и воздействие его на клетки эпителия. Подавление компонентов этой оси передачи сигнала от гематопоэтических клеток к эпителиальным может стать эффективной стратегией для лечения и/или предотвращения рака.

Развитие многих раков человека, в том числе рака поджелудочной железы (ПЖЖ), сильно ускоряется при хронических воспалениях. Но информации о молекулярных механизмах, обеспечивающих это ускорение, пока недостаточно. Среди клеток, связанных с воспалением, Т-хелперные клетки (Т_Н17), продуцирующие интерлейкин-17, играют активную роль и при хроническом воспалении, и при онкогенезе, индуцированным воспалением. Дифференцировка Т_Н17 происходит с участием IL-6 и TGF-β, которые присутствуют в микроокружении раковой опухоли ПЖЖ. Авторы исследовали роль продуцирующих IL-17 гематопоэтических клеток на ранних стадиях неоплазии ПЖЖ.

В то время, как фактор транскрипции RORγt, контролирующий дифференцировку продуцирующих IL-17 Т-клеток, практически отсутствует в нормальной ткани ПЖЖ, иммуногистохимическое исследование обнаружило его в клетках стромы ацинарно-дуктарной метаплазии (ADM), на ранних и продвинутых стадиях интраэпителиальной неоплазии (PanIN). Рецептор А IL-17 (IL-17RА) также отсутствовал в нормальной ткани, слабо экспрессировался в ADM и активно в PanIN.

Функциональное значение IL-17 на ранних стадиях неоплазии исследовали на модельных мышах. Индуктор панкреатита церулеин через 4 недели после активации онкогенного Kras^G12D вызывал у животных PanIN. Сочетанный эффект Kras^G12D и панкреатита вызывал синергичную и очень сильную активацию экспрессии IL-17 как в CD4⁺-, так и в γδTCR⁺-популяциях клеток очагов панкреатита. Подавление CD4⁺-Т-клеток – предшественников продуцентов IL-17 значительно замедляло формирование PanIN, что позволило предположить пронеопластический эффект продуцирующих IL-17 Т-клеток при формировании PanIN.

Введение мышам аденовирусного вектора, несущего ген IL-17А, сильно ускоряло возникновение и прогрессию PanIN подобно тому, как это происходило под действием церулеина. При подавлении продукции IL-17А гематопоэтическими клетками эти процессы сильно замедлялись. Нейтрализация пути функционирования IL17А при введении мышам смеси антител против IL17А+ IL17RА сопровождалась таким же эффектом.

В нормальной эпителиальной ткани ПЖЖ антитела против IL17RА выявляли лишь минимальные количества этого белка. Но в базальной мембране ADM и в эпителиальных клетках PanIN его экспрессия оказалась весьма активной. Мутантный Kras^G12D еще сильнее активировал экспрессию IL17RА в PanIN. В результате введения мышам смеси антител против IL17RА, IL17А и IL17F в эпителиальных клетках PanIN резко подавлялась экспрессия генов сигнальных путей, контролируемых IL17.

Полученные результаты показывают существование контролируемой IL17 оси передачи сигнала от гематопоэтических к эпителиальным клеткам, и этот вектор представляет собой важнейший регулятор на ранних стадиях неоплазии ПЖЖ. Компоненты оси потенциально могут быть мишенями для лечения и/или предотвращения рака ПЖЖ.


Источник: McAllister F, Bailey JM, Alsina J, Nirschl CJ, Sharma R, Fan H, Rattigan Y, Roeser JC, Lankapalli RH, Zhang H, Jaffee EM, Drake CG, Housseau F, Maitra A, Kolls JK, Sears CL, Pardoll DM, Leach SD. Oncogenic Kras Activates a Hematopoietic-to-Epithelial IL-17 Signaling Axis in Preinvasive Pancreatic Neoplasia. // Cancer Cell. 2014; V. 25: P. 621-637.

Подпись к рисунку: Микрофотография интраэпителиальной неоплазии поджелудочной железы (PanIN).

---

Поблагодарили (1): Vadim Sharov

Конференция будет проводиться в Московском физико-техническом институте с 29 сентября по 3 октября 2014. В мероприятии будут принимать участие ведущие мировые лидеры в данной области.

Подробнее узнать о Конференции, зарегистрироваться и подать тезисы можно по ссылке http://biomembranes2014.ru/

Исследование биомембран занимает центральное место в молекулярной и клеточной биологии. Биомембраны отграничивают внутреннее содержимое клетки от внеклеточного пространства и состоят преимущественно из липидов и мембранных белков. Мембранные белки опосредуют взаимодействие между клеткой и окружающей средой, а также между соседними клетками, участвуя в транспорте ионов, питательных веществ, передаче сигналов и преобразовании энергии. Их дисфункции зачастую приводят к развитию таких тяжелых заболеваний, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, диабет, рак, инфаркт и многих других. Несмотря на то, что мембранные белки составляют лишь около трети белков, закодированных в геноме человека, 60-70% современных лекарственных средств имеют в качестве своих мишеней именно мембранные белки, что подчёркивает их ключевое значение для фармакологии и медицины. Биологические мембраны находятся в фокусе интенсивных фундаментальных исследований в области физики мягкой материи и теоретической физики.


В настоящее время такие методы, как рентгеноструктурный анализ, рассеяние нейтронов, электронная микроскопия, спектроскопия ЯМР, масс-спектрометрия и флуоресцентная микроскопия сверхвысокого разрешения, являются ключевыми методами исследования структурных аспектов и молекулярных механизмов функционирования биомембран и мембранных белков с временным разрешением от фемтосекунд до минут и в пространственных масштабах от атомов до целых организмов.

В последние годы было совершено множество ключевых технологических прорывов, позволяющих работать в новых направлениях и парадигмах в области исследования биологических мембран. В связи с этим главной целью Конференции является обсуждение ключевых современных достижений в этой области, включая и сследования с помощью рентгеновского лазера на свободных электронах (XFEL).

В мероприятии примут участие учёные мирового уровня в области структурной биологии, биофизики и физики мягкой материи. В их числе ключевые докладчики: Prof. Ernst Bamberg, Институт Биофизики Макса Планка (Германия), Prof. Raymond Stevens, Исследовательский Институт Скрипсс (США), институт iHuman (Китай)
До встречи на Конференции!

Регистрация - до 10 августа.
Подача тезисов - до 1 сентября.

Конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст»-2014

«Биомолекула» ежегодно проводит конкурс на лучшую научно-популярную публикацию в области современной биологии. Четвертый конкурс «био/мол/текст» приглашает авторов, способных корректно, доступно и с задорной искрой рассказать читателю о достижениях биомолекулярной науки. В этот раз особое внимание мы уделим биоинформатике.

Современная биология — увлекательная и динамично развивающаяся наука. Ежегодно исследовательские лаборатории по всему миру публикуют сотни тысяч научных статей. Неспециалисту, который тем не менее хочет быть в курсе последних достижений науки о жизни, легко потеряться в этом потоке информации. «Биомолекула» пытается донести эти знания в доступной форме до всех желающих и приглашает начинающих (и не только!) авторов попробовать свои силы в этом благородном деле.

Уже в четвертый раз мы проводим конкурс научно-популярных статей «био/мол/текст» и приглашаем для начала ознакомиться с результатами состязаний прошлых лет: 2011, 2012, 2013. Прошлогодний конкурс благодаря сотрудничеству с Летней школой «Биотехнологии будущего 2013» собрал около 60 работ, прошедших предварительный отбор в редакции.

Особенностью конкурса этого года является новая номинация — биоинформатика, созданная при поддержке Института биоинформатики. Современные «омные» исследования, использующие высокопроизводительные (high-throughput) технологии, генерируют огромные объемы данных, разобраться в которых без привлечения методов биоинформатики просто невозможно. Поэтому эта область заслуженно выделяется в отдельную номинацию, в которой в качестве эксперта выступит ведущий научный сотрудник Национального центра биотехнологической информации США Евгений Кунин — один из «отцов-основателей» биоинформатики.

Основная тематика конкурса: молекулярная биология и биофизика, биомедицина и био- и нанотехнологии, а также биоинформатика.

Сроки проведения конкурса: работы принимаются с 1 июля по 31 октября 2014 г. Результаты конкурса (согласно решению жюри) будут обнародованы в декабре 2014 г. на сайте biomolecula.ru.

Подробнее: http://biomolecula.ru/content/1437

реклама

Новый приход реагентов для секвенаторов ABI 3100, 3130, 3500, 3730!

В ближайшие две недели мы планируем пополнить складские запасы полимеров NanoPOP 7 и BrightDye. Реагенты не только очень доступны по цене, но и будут у нас на складе в Москве.

Резервировать товар можно уже сейчас!

Молекулярно-биологические события, как и любые другие химические реакции, зависят от температуры. Следовательно, должны существовать определенные механизмы, обеспечивающие тонкую подстройку большого числа взаимосвязанных биохимических процессов, и придающие системе устойчивость, надежность (robustness). Без таких подстроечных механизмов и эмбриональное развитие, и поддержание нормальной организации тканей при отклонении температуры от оптимальной было бы невозможно. Тем не менее, исследований на эту тему поразительно мало.

Недавно британские ученые на модели дрозофилы выяснили механизмы термокомпенсации активности сигнального каскада Notch. Напомним, что сигнальный каскад Notch активируется при связывании трансмембранного лиганда Delta (на поверхности соседней клетки) с рецептором Notch, что приводит к протеолитическому отщеплению С-конца Notch, который перемещается в ядро и выступает там в качестве транскрипционного активатора. Однако, существуют механизмы лиганд-независимой регуляции какскада Notch, связанные с эндоцитозом. В одном случае, Notch попадает в лизосомы при участии клатрина и белка Deltex (Dx), что приводит к активации каскада. В другом случае, при участии suppressor of deltex (Su(dx)), и холестерол-богатых мембранных доменов, Notch отправляется в ранние эндосомы, что приводит к его деградации и подавлению каскада. Мутация по Dx является температурно-чувствительной, что привело авторов к идее о его роли в термокомпенсации каскада. Используя различные мутантные производные Notch, они изучили влияние температуры на активность компонентов каскада по отдельности. Выяснилось, что активность Dx не зависит от температуры, тогда как Su(dx)-опосредованный эндоцитоз возрастает при повышении температуры, что приводит к компенсации усиления лиганд-зависимой активности каскада при повышении температуры. Исходя из экспериментальных данных, авторы построили математическую модель каскада, адекватно описывающую поведение каскада как в норме (при разных температурах), так при мутациях. Таким образом, данная работа является важной вехой в изучении механизмов термокомпенсации основных сигнальных каскадов животных.


Картинка из preview к рассматриваемой статье (R6, R7, R9 -точки активации каскада, соответствующие дифференциальным уравнениям в мат. модели каскада). Dx и Su(dx) пути пересекаются при сортировке в ранних эндосомах, что обеспечивается, предположительно, белком Krz.

Источники
preview: Delidakis. Tempering Temperature Changes for Robust Development. Cell 2014, Volume 157, Issue 5, p1010–1012.

статья: Shimizu et al. Compensatory Flux Changes within an Endocytic Trafficking Network Maintain Thermal Robustness of Notch Signaling. Cell 2014, Volume 157, Issue 5, p1160–1174.

---

Поблагодарили (1): Vadim Sharov

Международная молодёжная научная школа
«Молекулярные и клеточные основы ранней эволюции жизни»
Москва, 22-26 сентября 2014 года

РЕГИСТРАЦИЯ УЧАСТНИКОВ
Для участия в молодёжной научной школе «Молекулярные и клеточные основы ранней эволюции жизни», которая пройдет 22-26 сентября 2014 г. в Москве, приглашаются студенты, аспиранты и молодые учёные (до 35 лет), интересующиеся вопросами происхождения жизни на Земле и механизмами эволюции живой материи.

Для участия необходимо зарегистрироваться по адресу http://oparin2014.inbi.ras.ru/registration.ru.php.

Окончание регистрации – 10 сентября 2014 г. Окончание приема тезисов стендового сообщения – 15 августа 2014. Участие в школе бесплатно для всех студентов и молодых ученых до 35 лет.

НАУЧНЫЕ ЗАСЕДАНИЯ ШКОЛЫ
Регистрация участников на мероприятии начнется в понедельник 22 сентября в конференц-зале Института биохимии им. А.Н. Баха (Ленинский проспект, 33, корпус 2, 3-й этаж) в 10:00. Лекции, постерная сессия, и дискуссии Школы 22 и 23 сентября будут проводиться в этом же зале. Заседания 22 и 23 сентября будут проходить на русском языке, и ставят целью в популярной и доступной форме ввести слушателей в проблему возникновения жизни и ранней эволюции.

Далее, с 24 по 26 сентября, все научные заседания будут проводиться в здании Президиума РАН (Ленинский проспект, 32А). Заседания 24-26 сентября пройдут на английском языке и будут включать доклады ведущих ученых в данной области по теме их исследований. Синхронный перевод не предусмотрен.

Научная программа будет доступна по адресу http://oparin2014.inbi.ras.ru/programm.ru.php

Подробнее: http://oparin2014.inbi.ras.ru/school.ru.php