Кто-нибудь клонировал гены из бактерий спомощью PCR на лигазной смеси (лигируеш хромосому, по разным рестриктазам, в вектор и ставиш PCR на лигазной смеси с праймером на консервативный участок и со стандартным)?
Я таким образом вытащил N конец(из 5-ти рестриктаз 4 дали продукт, из них 2 -нужного размера), заказал на него праймер, и с этим праймером PCR не идет(только против консервативного), перепробовал 10 рестриктаз, и две мелкощепящие с недорестриктом - глухо.
Может у кого есть идеи по этому поводу, а то у меня творческий кризис.
 
| |
[ Вход | Регистрация ]
|
PCR-клонирование
Anonymous, 23.05.2001 12:41
Anonymous, 23.05.2001 12:54
Если можно, то поточнее исходные данные. Что это за консервативный участок?
З.Ы.А что, сиквенса данной бактерии не существует?
З.Ы.А что, сиквенса данной бактерии не существует?
Anonymous, 24.05.2001 13:55
Сиквенса данной бактерии не существует, зато существуют сиквенсы этого гена из других бактерий (не помню точно, кажется штук шесть я нашел), они друг с другом почти не гомологичны, но есть небольшой гомологичный участок, названный мною, в предыдущем послании, "консервативным".
Anonymous, 30.05.2001 14:15
Ага, понятно.
Теперь дальше. Как я понял ты вытащил какой-то фрагмент из бактерии, отсеквенировал, заказал на него второй праймер и ПЦР не пошел?
Теперь дальше. Как я понял ты вытащил какой-то фрагмент из бактерии, отсеквенировал, заказал на него второй праймер и ПЦР не пошел?
Anonymous, 31.05.2001 14:38
Против первого праймера из этой бактерии он (PCR) идет, но он не идет против стандартного праймера на лигазной смеси.
Anonymous, 01.06.2001 13:18
Ну во-первых, это даже не совет, - поменять праймер или его направление.Если я все правильно понял, то картинка такая:
-> <-
====:------------------============---------
MCS N-unknown conserv. unknown
-> new primer
Дальше можно заказать праймеры направленные наружу от твоего секвенированого участка и ставить следующим образом: хромосому долбить рестриктазами, которых нет внутри, сильно разводить, кольцевать и ПЦР с этих праймеров.
Или еще вариант, сделать клонотеку и гибридизовать с фрагментом.
-> <-
====:------------------============---------
MCS N-unknown conserv. unknown
-> new primer
Дальше можно заказать праймеры направленные наружу от твоего секвенированого участка и ставить следующим образом: хромосому долбить рестриктазами, которых нет внутри, сильно разводить, кольцевать и ПЦР с этих праймеров.
Или еще вариант, сделать клонотеку и гибридизовать с фрагментом.
Anonymous, 01.06.2001 13:22
Тьфу, в картинке пробелы сожрались.
Anonymous, 01.06.2001 13:51
Не ясно насколько ты все правильно понял т. к. пробелы действительно сожрались.
Менять праймер не имеет смысла, поскольку он нормально отжигается (против 1-го), менять его ориентацию тем более не имеет смысла, поскольку праймер на N-конец направлен в сторону C-конца, если я поменяю ориентацию, будет PCR-ится область перед геном (а мне нужен ген).
Я пробова PCR-ить с двух, частично перекрывающихся праймеров в разные стороны на закольцованом рестрикте хромосомы - ничего не вышло ( к стати - зачем "сильно разводить"?).
Остается только гибридизовать, но очень не хочется (ни разу не делал, а пока метод поставиш куча времени уйдет, а тут лето).
Менять праймер не имеет смысла, поскольку он нормально отжигается (против 1-го), менять его ориентацию тем более не имеет смысла, поскольку праймер на N-конец направлен в сторону C-конца, если я поменяю ориентацию, будет PCR-ится область перед геном (а мне нужен ген).
Я пробова PCR-ить с двух, частично перекрывающихся праймеров в разные стороны на закольцованом рестрикте хромосомы - ничего не вышло ( к стати - зачем "сильно разводить"?).
Остается только гибридизовать, но очень не хочется (ни разу не делал, а пока метод поставиш куча времени уйдет, а тут лето).
Anonymous, 01.06.2001 18:14
"Сильно раззводить" - для того, чтоб при кольцевании у тебя не образовывались мультимеры, которые потом не амплифицируются.
Это кстати и вероятная причина неудач. Эту процедуру я провожу постоянно на разных колийных штаммах. Концентрация ДНК при этой процедуре должна быть ниже или равна 1 нг/мкл.
Рестриктазу нодо брать что-нибудь типа Sau3A. И ставить длинный ПЦР с хорошей длинной полимеразой.
(надеюсь, что у тебя частично перекрывающиеся праймеры не жгутся друг на друга).
Гибридизация штука несложная, но геморройная. Основная проблема в постановке ник-трансляции и доставании метки.
Это кстати и вероятная причина неудач. Эту процедуру я провожу постоянно на разных колийных штаммах. Концентрация ДНК при этой процедуре должна быть ниже или равна 1 нг/мкл.
Рестриктазу нодо брать что-нибудь типа Sau3A. И ставить длинный ПЦР с хорошей длинной полимеразой.
(надеюсь, что у тебя частично перекрывающиеся праймеры не жгутся друг на друга).
Гибридизация штука несложная, но геморройная. Основная проблема в постановке ник-трансляции и доставании метки.
totosite, 18.12.2020 07:23
I was impressed by your writing. Your writing is impressive. I want to write like you.I hope you can read my post and let me know what to modify. My writing is in "". I would like you to visit my blog.
totosite, 18.12.2020 07:24
Don't go past my writing! Please read my article only once. Come here and read it once"".
totosite, 18.12.2020 07:25
I am a fan who has watched your writing from before.I have learned a lot from you. Please come to my "" and help me.
totosite, 18.12.2020 07:26
How did you think of this? I think you can help me. Come here to help.
totosite, 18.12.2020 07:27
Thank you so much for reading your post. Your writing was helpful in my life.You brought my life back to life. Thank you so much and thank you so much.
emilybyrne, 19.12.2020 07:30
Definitely feel whatever you stated. Your chosen justification appeared to be around the web the particular simplest factor to be familiar with. My partner and I say to an individual, My partner and I definitely acquire irked although folks consider problems which they plainly do not find out about. An individual was able to strike the particular toenail after the most notable and identified out there the whole lot with no side effect, folks can require a signature. Can likely become again to obtain additional. Thank you.
emilybyrne, 22.12.2020 05:20
I loved as much as you will receive carried out right here. The sketch is tasteful, your authored subject matter stylish. nonetheless, you command get bought an edginess over that you wish be delivering the following. unwell unquestionably come further formerly again since exactly the same nearly a lot often inside case you shield this increase.
emilybyrne, 26.12.2020 14:55
Just wish to state your own post is really amazing. The actual clarity inside your publish is actually just nice as well as we could presume you're a specialist about this topic. Fine together with your authorization let me personally to seize your own feed to maintain updated along with future publish. Many thanks for the zillion as well as make sure you continue the actual rewarding function.
emilybyrne, 30.12.2020 09:04
Thanks regarding revealing superb informations. The web site will be so great. I am pleased with the information in which you've with this web site. That unveils just how effectively an individual perceives this kind of subject matter. Bookmarked this kind of web page, should come again regarding extra posts. An individual, my own pal, STONE! I came across simply the particular info My partner and I previously researched all over the place and also simply couldn't encounter. Just what a perfect website.
bhuvnes, 31.12.2020 08:09
Я таким образом вытащил N конец(из 5-ти рестриктаз 4 дали продукт, из них 2 -нужного размера), заказал на него праймер, и с этим праймером PCR не идет(только против консервативного), перепробовал 10 рестриктаз, и две мелкощепящие с недорестриктом - глухо.
emilybyrne, 03.01.2021 07:24
I loved as much as you will receive carried out right here. The sketch is tasteful, your authored subject matter stylish. nonetheless, you command get bought an edginess over that you wish be delivering the following. unwell unquestionably come further formerly again since exactly the same nearly a lot often inside case you shield this increase.
bhuvnes, 04.01.2021 15:26
In questo blog troverai l’elenco dei migliori siti di sottotitoli in italiano di film e serie TV.
kimkibang, 31.01.2021 17:16
this is one very interesting post. I like the way you write and I will bookmark your blog to my favorites.
kimkibang, 31.01.2021 17:21
Nice information, valuable and excellent design, as share good stuff with good ideas and concepts.
안전놀이, 07.03.2021 10:44
That's a really great post. This article will surely be of great help to many people. I would like to share it on my website and see it with many people.
먹튀검증, 07.03.2021 10:44
That's a really well-organized article! Your writing is really interesting. Please continue to write a lot in the future. supports you.
bondbond, 21.03.2021 11:05
overseas spectators, saying, "I was frustrated with the holding of a full form," and "I face doubts that the event will be held.
bondbond, 21.03.2021 11:06
However, it is not known whether public opinion related to the hosting of the Olympics will improve with this decision, Kyodo News Agency evaluated. Asahi Shimbun also diagnosed with the abandonment of
watchesbiz, 27.09.2021 17:13
watchesonline89, 24.12.2022 11:34
Это — лёгкая версия форума. Чтобы попасть на полную, щелкните здесь.