Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Cruel Участник ~ |
|
bukach Постоянный участник Geneva, Switzerland |
(Cruel @ 15.05.2008 16:34) А нужно ли подвергать воздействию 95С 5мин образец, денатурированный в 8М мочевины? Т.е. получается, что денатурация в этом случае проходит дважды? не то что бы не нужно, но нежелательно. но не из-за "дважды денатурации", а карбамоилирования и пр. |
Cruel Участник ~ |
не то что бы не нужно, но нежелательно. но не из-за "дважды денатурации", а карбамоилирования и пр. тогда я могу эти образцы смешивать с 5хsds-page sample buf. и наносить? т.е. получается, что белки побегут в обычном белковом геле? я имею ввиду, что в геле нет мочевины и пр. |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Если хотите восстановить S-S связи, то придется. Или ждать пока они востановятся сутки, другие. Несмотря на --"карбамоилирования и пр." Я бы кипятиил в SDS, а потом сыпал бы сухую мочевину, до нужной концентрации. -тогда я могу эти образцы смешивать с 5хsds-page sample buf. и наносить? Ага, у вас образцы по ходу, до анализа в мочевине. Ага, меня всегда весилил 5х буфер растворимый только при 60 градусах. Можете добавить SDS чуть-чуть(0.1-0.2%) и глицерина для плотности. Не нужен вам там ведерный SDS. Просто в 8М мочевине SDS с белками практически не вяжется и его присутствие в пробе, по большому счету ничего не решает. -- т.е. получается, что белки побегут в обычном белковом геле? я имею ввиду, что в геле нет мочевины и пр. Если в геле будет мочевина, то это уже не будет Лэмли форез. SDS не будет связываться с белками и они будут делится не по массе, а по массе и заряду. К тому же щелочные белки вообще не войдут в гель при таком раскладе. Возможны и более размытые зоны. У вас мочевина останется в кармане. А белочек будет входить в гель без нее. Если SDS-а не хватит, что бы растворить белок(а SDS из пробы и ЭБ будет сквозь мочевину со свистом пролетать) при вхождении в гель будут осадки(шлейфы от кармана по гелю в концентрирующем и начале разделяющего геля). С другой стороны очень много SDS в геле и в ЭБ будут рождать артефакты. Так что если будут осадки, то можно просто повысить концентрацию SDS в пробе. Возникновение осадков зависит от концентрации белка в пробе и от его личной вредности агрегировать из денатурированного состояния. |
Cruel Участник ~ |
Спешу поблагодарить ответивших на мои предыдущие посты - спасибо ребята! теперь вот, состав моих: 30% acrylamide/0,8 bis-acrylamide; 2.5x separating gel buffer: 1.875 M Tris·Cl, 0.25% SDS pH 8.9; 5x stacking gel buffer: 0.3 M Tris·phosphate, 0.5% SDS pH 6.7; 5x electrophoresis buffer: 0.5 M Tris, 1.92 M glycine, 0.5% SDS pH 8.8; 5x SDS-PAGE sample buffer: 0.225 M Tris·Cl, pH 6.8, 50% glycerol, 5% SDS, 0.05% bromophenol blue; делаю пробы так: 1 объем 5x SDS-PAGE sample buffer и 4 объема образца. В методике написано, что после смешивания пробу можно наносить. Вопрос: надо ли мне эти пробы кипятить? если образец: белок + (100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris·Cl, 8 M urea pH to 8.0). мое мнение: не нужно. Сообщение было отредактировано Cruel - 20.05.2008 12:19 |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Cruel Участник ~ |
просто иногда как-то клинит, вроде все понятно, а получается, что надуманно. |
Дюймовочка IP-штамп: frzU85/cFFizQ гость |
|
Дюймовочка IP-штамп: frzU85/cFFizQ гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
НО! Даже если учесть, что Миллимитровочка описалась и это всего лишь 80mA, для 15V ток великоват. Доложите какое у вас общее сечение и длина геля. --После окрашивания геля дорожки получаются размытыми и неровными. Неровными это как? Извилистыми, чи шо? Если извилистые, то вы, Миллимитровочка, плохо исходный раствор для геля перемешиваете. -- А в другой раз и вообще на некоторых дорожках белков и не видно. А от того и не бачите, шо нема. Я лично сильно сомневаюсь, что на 10% геле будут видны белки растворимые в 70% спирте, они скорее всего уйдут с фронтом. -- У меня крутятся в голове мысли, что может краска плохая Это вряд ли, но можете попробовать перед окраской вымочить гель в 40% спирте(или метаноле). -- или может быть экстрагенты как то влияют? Еще как, При чем все вами описанные. Соль сильно размывает зоны и дает шмеры. Щелочь по идее тоже должна размывать зоны. А спиртовые белки могут выпадать в осадок при входе в гель. ---Или еще что-то..... Да много чего. Например, качество акриламида, бис'а, Трис'а, SDS и глицина. А так же правильность рН в буферах для геля. |
guest: Гость IP-штамп: frzU85/cFFizQ гость |
Доложите какое у вас общее сечение и длина геля. Длина геля где-то 7 см, ширина - 8 см, а толщина где-то 2 мм. Соль сильно размывает зоны и дает шмеры. Щелочь по идее тоже должна размывать зоны. А спиртовые белки могут выпадать в осадок при входе в гель Может быть стоит попробовать выделить белки экстрагентами в более низких концентрациях??? Или не поможет? |
Гость IP-штамп: frylpe1IIoRJI гость |
и вопрос второй: на каком вольтаже нужно гнать гель? |
Гость IP-штамп: fr3fNXtWnlk/U гость |
|
Knizhnik |
|
НЮСЛИК IP-штамп: frRqrRwAZVaJ6 гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Ктон -нибудь разгоняет, но не я. А беда от того что нада казеин сначало створожить. |
НЮСЛИК IP-штамп: frRqrRwAZVaJ6 гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Какие фракции? Чем фракции отличаются, тем способом и разделять. --и как сыворочные белки по отношению к казеиновым себя ведут. Никак, плавают в молоке. В чем ваш вопрос? |
нюслик IP-штамп: frRqrRwAZVaJ6 гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Нет так еще непонятнее будет. Сколько белков столько методов как выделения, так и идентификации. Например лактопероксидазу можно просто по активности цветной реакцией определять. Имуноглобулины А имунохимически. Ну и тд. |
aed1986 |
Хочу провести электрофорез гуминовых кислот, но никак не могу найти методику. Если есть такая информация, пожалуйста поделитесь! |
guest: plotter IP-штамп: frlnAsDr.5x7A гость |
Камера хеликоновская (течет кстати жутко, лучше покупайте биорад), гребенки вроде тефлоневые, прилипать не должны... |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Скорее всего Бис подразвалился или ПСА(ТЕМЕД) протухли. |
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
|
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Ну, у меня больше нет мыслей, кроме как: концентрации не соблюдены, или набор кривой, или руки кривые. Я бы все же начал с проверки Биса вполне возможно, что вам дали вовсе не тот что был в бутылочке, которой пользуются. Разделяющий гель концентрированей концентрирующего и поэтому там не так заметно ухудшение механических свойств геля - это естественно. |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
В бензобаке автомобиля - приемлимо, а вы про что спрашиваете? |
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Так там можно даже дистиллятом наслаивать. А бутанол(изобутанол) даже удобней, он с водой не смешивается. |
bsm Постоянный участник |
Спсб. |
Olga Vik Бирмингем, США |
(bsm @ 02.12.2008 21:35) Коллеги подскажите, меркаптоэтанол в белковом растворе должен присутствовать обязательно, или могут быть варианты... и как скажется его отсутствие на активности различных ферментов в геле. Спсб. вроде в геле уже нет ничего активного если не ошибаюсь, меркаптоэтанол способствует денатурации (наряду с SDS): под его воздействием происходит восстановление дисульфидных связей, что предотвращает выпетливание денатурированных полипептидов и повышение их подвижности. читала статью, в которой его специально не добавляли - такой "неденатурирующий" форез, использовали для проверки на наличие дисульфидных связей. Сообщение было отредактировано Olga_Vik - 02.12.2008 22:07 |
bsm Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано bsm - 02.12.2008 22:11 |
Olga Vik Бирмингем, США |
(bsm @ 02.12.2008 22:10) есть информация, что меркаптоэтанол в небольших кол-вах (1-5%) добавляют в исследуемый раствор ферментов для предотвращения их от окисления и образования дисульфидных мостиков! вообще-то это тема по электрофорез белков, поэтому сразу уточнить стоило о чем спрашиваете =) только вот про "активность белков В ГЕЛЕ" так и не поняла... Сообщение было отредактировано Olga_Vik - 02.12.2008 23:03 |
bsm Постоянный участник |
|
Olga Vik Бирмингем, США |
(bsm @ 02.12.2008 23:30) |
bukach Постоянный участник Geneva, Switzerland |
полагаю, что в гель МЭ добавить не получится - он не должен полимеризоваться. ПСА пойдёт на окисление МЭ, а не на полимеризацию акриламида. есть наверное заряженные восстановители, которые можно добавить в електродный буфер, если форезная система гомогенная (одинаковые буферы в геле и электродный), то и загнать прераном. вообще, преран лучше сделать, чтобы избавиться от остатков ПСА и растворы дегазировать - меньше кислороду - меньше окисления. а проверить влияние восстановителей на ваш фермент можно? |
bsm Постоянный участник |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
Легче проверить, чем дать априорный адекватный ответ. |
bsm Постоянный участник |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Гость IP-штамп: frt2DxpMm4dqI гость |
Допустим, не буду ли я иметь сдвиг градиент вниз у центра, если заливаю из миксера в центр? |
Гость IP-штамп: frt2DxpMm4dqI гость |
Допустим, не буду ли я иметь сдвиг градиент вниз у центра, если заливаю из миксера в центр? |
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
А так мое мнение такой 3% глицерин в оба раствора и не спешить с заливанием. А с какого краю в общем пофигу. |
Гость IP-штамп: frwgDuY2GuOp. гость |
|
plotter Постоянный участник Стыдно признаваться о том, где живу... |
|
Raido Москва |
|
Эмин |
|
Raido Москва |
|
Guest IP-штамп: frSyN0sznPM3. гость |
|
Гость IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |