Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
Концентрации веществ, влияющих на PCR реакцию. Указаны значения, при которых присутствие этих веществ не сказывается на PCR. Красители. Вещества, улучшающие специфичность (и/или) выход PCR реакции. Детергенты. Другие вещества. |
Цыгира |
BSA 10 µg/ µl ~0.1 µg/ml стабилизация фермента надо BSA 10 µg/ µl ~0.1 µg/µl стабилизация фермента |
гость: G IP-штамп: fr4nm6i88vv/M гость |
|
Гость IP-штамп: fr3PpYUagJAXg гость |
Уважаемые коллеги! У меня проблема. Для сиквенса 16s ставила ПЦР с праймерами f27-r1392 и f530-r1525. Получала толстый фрагмент, но под ним шла паразитная полоска с низкой концентрацией в каждом случае. Элюировала толстую полосу из геля и ставила ре-ПЦР с теми же праймерами и еще с внутренними: с матрицы f27-r1392 ставила с праймерами 40-1392, 357-1392, с матрицы f530-r1525 с праймерами 530-1492. Во всех случаях та же самая история - идет дополнительная полоса. Вряд ли это внутреннее праймирование, но я боюсь, что при сиквенсе будет ерунда. Насколько плачевна моя ситуация? Может, я гоню волну? Заранее благодарна за ответ. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
|
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
1: Anal Biochem. 1990 May 1;186(2):328-31. Links Minimizing the time required for DNA amplification by efficient heat transfer to small samples. * Wittwer CT, * Fillmore GC, * Garling DJ. Department of Pathology, University of Utah Medical School, Salt Lake City 84132. Hot-air temperature cycling of 1- to 10-microliters samples in glass capillary tubes can amplify DNA by the polymerase chain reaction in 15 min or less. A rapid temperature cycler of low thermal mass was constructed to change sample temperatures among denaturation, annealing, and elongation segments in a few seconds. After 30 cycles of 30 s each, a 536-bp beta-globin fragment of human genomic DNA was easily visualized with ethidium bromide on agarose gels. With rapid cycling, amplification yield depended on polymerase concentration. The time required for DNA amplification can be markedly reduced from prevailing protocols if appropriate equipment and sample containers are used for rapid heat transfer to the sample. PMID: 2363506 [PubMed - indexed for MEDLINE] |
Sveta Tim Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
|
Solaris |
|
Гость IP-штамп: frmSv/J0jZDWc гость |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 14.03.2008 16:41) Привет! как избавиться от неспецифики при ПЦР??? Что только уже не пробовала? Подскажите!Заранее спасибо! Правильно выбранные праймеры работают без неспецифики даже бе хотстарта и волшебных добавок. Праймеры в студию и "чистосердечные признания"! |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 14.03.2008 17:01) Правильно выбранные праймеры работают без неспецифики даже бе хотстарта и волшебных добавок. Праймеры в студию и "чистосердечные признания"! а иначе -расстрел на месте без последнего "Прощай" |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 14.03.2008 16:41) Привет! как избавиться от неспецифики при ПЦР??? Что только уже не пробовала? Подскажите!Заранее спасибо! Вина красного сухого пробовали? Советую не более двух бокалов. Это у меня такие тяпничные советы как ПЦР улучшить. |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 14.03.2008 17:19) Вина красного сухого пробовали? Советую не более двух бокалов. Это у меня такие тяпничные советы как ПЦР улучшить. А у тебя что - уже рабочий день закончился ? |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 14.03.2008 17:23) А что, хочешь предложить сообразить на троих? Конечному продукту только дай знак - всегда готов. |
Гость IP-штамп: fr32TkPWTePOw гость |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 05.06.2008 06:22) Сначала в этаноле, 1 или 10%. После растворения в воде, автоклавировать. Следовые количества DEPC сильно ингибируют RT и PCR.
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 08.08.2008 08:15) Кuzminka :'( : кто-нибудь когда-нибудь пользовался набором для выделения ДНК, а именно: Genomic DNA Purification Kit K0512 фирмы "Fermentas"? Проблема: после добавления преципитационного раствора к р-ру, содержащему ДНК и после центрифугир-я должен образоваться супернатант, но его мы не видим, мы чо слепые или чо??? Заранее спасибо за помощь! Т.е. хотите сказать, что не видите преципитат (осадок с ДНК)? А супернатант не видеть невозможно, даже если он прозрачный и бесцветный! . |
Guest IP-штамп: frGVIavw/5x.U гость |
|
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 11.08.2008 11:09) Если это после хлороформа, да. А если после "преципитационного раствора", нет: |
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 12.08.2008 11:38) Kuzminka: да, в том то и дело, что там должен образоваться осадок ДНК, но я его не вижу. В чем причина? Если Вы хотите увидеть осадок геномной ДНК из 200 мкл крови, то зря стараетесь. Не ищите преципитат ДНК, а делайте все по протоколу до конца. Угораздило же Вас купить неудобный набор для выделения ДНК из микрообъема крови. Это протокол удобен при выделении ДНК из больших объемов, более 1 мл крови. |
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Guest IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Гость @ 15.08.2008 08:05) Гликоген для мол.биол. Специальный, для соосаждения ДНК и РНК, без ДНК-аз и РНК-аз. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Гость @ 18.08.2008 06:24) Kuzminka: Thanks! А ск-ко вешать в граммах? Т.е.сколько его необходимо добавлять7 Заранее благодарю! With glycogen from IVGN (SKU# 10814-010) which is 20 ug/uL, just add 1 uL per Eppendorf (i e, 0.5-1.5 mL final volume) precipitation. Tip: Make sure you vortex your DNA solution after you added glycogen. |
metrim Постоянный участник Москва |
То что приведено - влияет скорее на функционирование полимеразы, а что может оказывать влияние, мешать комплиментарному связыванию праймера с матрицей, искажать процесс? |
Guest IP-штамп: fr4MbcymAiCcU гость |
из недавнего замечено, что RecA белочек тоже помогает убрать неспецифику. а в обсчем - удачные праймеры, оптимальный буфер и полимераза (или смесь) творят чудеса... |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |