Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
Обсуждение роли различных компонентов в PCR реакции: буфер; магний; dNTP’s; праймеры; полимераза, матрица. Оптимальные количества компонентов. Буфер для внесения. |
Гость IP-штамп: frUc3IzHqMYlk гость |
Буду отшень признателен. |
Гость IP-штамп: frW6PQ8r6IMNg гость |
|
Redactor admin. Берлин, Германия |
|
Гость IP-штамп: fr32TkPWTePOw гость |
|
Cathie22 Постоянный участник |
(Гость @ 18.04.2007 08:47) |
ssve Участник |
(Гость @ 18.04.2007 08:47) сток = stock это концентрированный раствор реагента, из которого готовятся конечные растворы |
Борт |
Сообщение было отредактировано Борт - 18.05.2007 20:35 |
Yuri K IP-штамп: fr5KDn9rv8TOA гость |
(Борт @ 25.04.2007 20:42) Тем, что с ним заносят избыток глицерина и пр. дряни. |
Гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf. гость |
Известно полный сиквенс гена. Подскажите пожалуйста, как определить праймера для ПЦР, Меня интересуют в первую очередь программы. |
error Постоянный участник 192.168.0.1 |
(Гость @ 02.09.2007 10:24) http://www.idtdna.com/Scitools/Applications/Primerquest/
|
Guest IP-штамп: frVUncTC1Qf86 гость |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(Guest @ 04.09.2007 10:13) Да, действительно, ошибки на 3-штрих конце праймерОВ могут сыграть роковую роль.
|
Гость IP-штамп: frDQwa9k7riYg гость |
|
comp3v Постоянный участник Москва |
(Гость @ 05.02.2008 14:07) да пофигу, главное чтобы смесь покрыло
|
seqvencer москва |
|
seqvencer москва |
|
Гость IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
|
D evgenii Постоянный участник Томск |
|
Cinderella Постоянный участник где-то в Сибири |
(seqvencer @ 11.02.2008 12:38) По мне могу сказать проверяйте хлорид магния. Очень коварный реактив. И почаще его меняйте для своих смесей. всмысле? чем коварен? |
Cinderella Постоянный участник где-то в Сибири |
(Гость @ 11.07.2008 07:52) Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С мне кажется лучше один из праймеров лучше поменять. что то очень большая разница. хотя я не знаю, если пцр не TagMan может оно и ничего. анализ колличественный? |
Guest IP-штамп: fr/eFUcux3Q2c гость |
|
D evgenii Постоянный участник Томск |
#, Vector NTI... |
Cinderella Постоянный участник где-то в Сибири |
я тут тоже долго вымучивала как и что, после всяких ехидничаний и посыланий мне все таки дали толковые советы. AlexanderL забавно. по-моему это прикольное разводилово ну да всё равно, может кому пригодится. 1. идёте сюда и находите свой ген, например AFP 2. на странице гена в разделе Genomic regions, transcripts, and products слева от схемки выбираете сини ссылки на mRNA (их может быть много), в открывшемся крохотном окне выбираете Genebank (про FASTA тоже помните на будущее) 3. на странице данной мРНК можете всё про неё узнать, в том числе границы экзонов. ну и саму последовательнсоть в самом конце 4. но работать удобнее с той же последовательнсотью в формате FASTA (идёте теперь по этой ссылке). 5. копируете эту последовательность в окно программы 6. подбираете праймеры. неудобство тольо в том, что могут появиться праймеры, которые не будут работать на ДНК или на альтернативных транскриптах этого гена. иногда удобнее, чтобы праймеры работали на чем угодно (геномная ДНК, альтернативные транскрипты). тогда с учетом пункта 3 надо выбрать из последовательности только куски отдельных экзонов (разумеется, чем больше экзон для этого выберете, тем больше шансов найти в нем удачную пару праймеров). PS для работы с последовательностями лучше использовать специальные программы, возможно, вы не находите какие-то из праймеров только потому, что они даны в комплементарном виде к цепи, на которой их ищете (в норме так будут выглядеть тольо обратные праймеры). вообщем... сочувствую |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Гость @ 11.07.2008 06:52) Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С Adjust primer concentrations. They do not have to be equal. |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Cinderella Постоянный участник где-то в Сибири |
(RJ Dio @ 11.07.2008 13:02) не знаю, мне понравилось. как то все картинки сложились, все по полочкам, систематизировалось. я по всяким базам раньше праймеры брала. как то знающие люди их проверили на всяких там программах типа бекондизайнер олиго аналайзер и т.д. сказали туфта, да и сама посмотрела - точно туфта, гомологов куча, Тм не совпадает с указанной... а из статей брать - опасненько. тоже накололась, поверила буржуям. есть правда нормальные, но там надо смотреть уже частности всякие, типа что и как использовали и для чего вообще. |
RJ Dio Постоянный участник |
|
Cinderella Постоянный участник где-то в Сибири |
(RJ Dio @ 11.07.2008 16:50) из статей- это точно, опасно бездумно копировать. Я хотел только сказать, что во многих случаях можно написать олиги просто глазками, работать будут не хуже Hi-tech-овых согласна. просто еще по базе выдают Тм и конц магния и кучу еще всякой информации. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(RJ Dio @ 11.07.2008 15:33) What, exactly, is "not true"? |
Guest IP-штамп: frWv/19onoXiA гость |
(Гость @ 11.07.2008 06:52) Подскажите пожалуйста что можно сделать если температура плавления прямого и обратного праймеров сльно отличается-52 и 74С Если праймеры в реакции в эквимолярных количествах, конечно 52 лимитирует. Но можно увеличить т. отж. аж до 58-60, но при условии многократного избытка (в 5 раз) 52-праймера. Очень часто пользуюсь этим приемом, не жадничаю. Согласен с Хрипиным. RJ Dio, ну попробуйте хоть разок. |
Гость IP-штамп: frT54xmo0Md42 гость |
|
Guest IP-штамп: frgIWK0EL18EY гость |
(Гость @ 20.07.2008 12:18) Знающие люди! Подскажите пожалуйста, из-за чего ещё могут образовываться димеры праймеров,кроме их высокой концентрации. Высокие концентрации праймеров на последнем месте. В первую очередь "горячий старт", далее "кривизна" праймеров (сильные 5-торчащие шпильки, селф-и кроссдимеры) и и высокая концетрация Mg (напрмер, 5 вместо 2,5 mM) или очень низкая Т отж. |
Yuri K IP-штамп: frbSxBL61s/9I гость |
(Guest @ 21.07.2008 13:29) With common PCR reagents/protocol, Mg2+ promotes P-Ds formation only up to 2.5-3 mM. At higher Mg2+ P-Ds are suppressed just as everything else is. |
The problem Постоянный участник |
|
Радимира Участник |
Сообщение было отредактировано Радимира - 01.08.2008 10:02 |
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
phen |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
|
akimovster Постоянный участник Новосибирск |
спасибо!!! |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(akimovster @ 24.10.2008 03:50) |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(akimovster @ 24.10.2008 03:50) Если разовая аликвотка - в 1-кратном ПЦР буфере, а если надо развести, например до 1 ед. на мкл, и хранить после использования - в буфере для хранения:50 mM Tris-Cl (pH 8.0 at 25 оC), 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 50% glycerol. Очень разбавленные ферменты плохо хранятся. |
Гость IP-штамп: fr32TkPWTePOw гость |
реально кто нибудь это так делал? праймеры восстанавливаются? это правда? у меня праймеры по моему сдохли. им уже больше года. есть подозрение, что они где то сильно повалалялись без меня... |
D evgenii Постоянный участник Томск |
Вскоре они опять сдыхают... |
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
(D_evgenii @ 03.03.2009 08:29) Это как - оживают, но опять сдыхают? |
Guest IP-штамп: fr45uHVgO7WZ2 гость |
(Ъ @ 03.03.2009 14:03) ну что тут непонятного - обычная реинкарнация |
D evgenii Постоянный участник Томск |
|
Guest IP-штамп: fr32TkPWTePOw гость |
(D_evgenii @ 03.03.2009 16:46) а как это делается? у меня праймеры храняться на -20 в ддН2О. были разлиты на аликвоты в эпендорфы. как их кипятить. где ? в каких условиях? можно немного поподробней. пустьхоть не долго, но хоть еще поработают. а то прям бермудский треугольник - летом все было хорошо, а после отпуска случилось какое то чудо - и все сдохли. а их много. пожалуйста поподробней |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |