Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
Forum robot Постоянный участник на сервере в Москве |
Выделение плазмидной DNA (минипреп - лизис щелочью). Лучший метод для получения pDNA высокого качества (годится даже для трансфекции). Его преимущества: очень низкая цена, высокая скорость (сравнима только с Qiaprep spin). Источник: Lee SY, Rasheed S. A simple procedure for maximum yield of high-quality plasmid DNA. Biotechniques. 1990 Dec; 9(6):676-9. |
Gosh Участник Berlin |
|
Гость IP-штамп: fre3LvFwDEw82 гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
|
Гость IP-штамп: fr1hCWLfmRvPM гость |
|
guest: ммм IP-штамп: frHvyGooYAnV2 гость |
Какой материал или на какой стадии выделения плазмиды, уточните. |
curious67 Постоянный участник |
(guest: ммм @ 27.09.2006 20:21) Вода, если недолгое хранение, но главное, с последующими реакциям в магниевых буферах, ТЕ если на длительное хранение или какая проба форезная для многоразового использвания и тд. вообще, старайтесь избегать использования ЕДТА, т.е. вместо ТЕ используйте просто 5-10 мМ Трис, и никакой воды. Трис нейтрального рН предотвратит гидролиз ЛНК, и ничему не помешает. А ЕДТА- это пережиток старых времен, когда Mg очень боялись, сейчас вроде методы поячище стали (а вот руки 0 нет, да...) |
Гость IP-штамп: frvlg5HAE9.1Q гость |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Гость IP-штамп: fr1hCWLfmRvPM гость |
|
Гость IP-штамп: frYnkP4R1lFec гость |
|
Гость IP-штамп: frYnkP4R1lFec гость |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Гость IP-штамп: frvlg5HAE9.1Q гость |
|
curious67 Постоянный участник |
|
Гость IP-штамп: frYnkP4R1lFec гость |
|
curious67 Постоянный участник |
|
green mouse Участник Москва |
|
curious67 Постоянный участник |
|
green mouse Участник Москва |
главное, плазмида, так выделенная, всегда ярко светится на форезе. надо будет методику выложить |
Guest IP-штамп: frdk4fFh7od4A гость |
|
Guest IP-штамп: frFNQ1Yb4qZoo гость |
(green mouse @ 18.10.2006 19:43) Мне больше нравится лизис кипячением. по маниатису. там только один тонкий момент - в кипяток надо опускать СРАЗУ после добавления лизоцима и держать 40 секунд мне больше нравится выделять квайджиновским китом хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было |
curious67 Постоянный участник |
|
Guest IP-штамп: frV5vmRe1gSXQ гость |
(Guest @ 21.10.2006 21:45) мне больше нравится выделять квайджиновским китом хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было А скажите, у вас хорошо хранится ДНК, выделенная китами? У меня почему-то хранится значительно хуже, чем выделенная ручками с солями; через полгода-год многие препараты, выделенные китами, выглядят развалившимися на форезе, или после рестрикции выглядят как сплошной шмер. Как у вас с этим? |
Atropos Постоянный участник abroad |
(curious67 @ 18.10.2006 11:42) А зачем pDNA лигазить или киназить? Да и вообще лигазу он похоже не ингибирует, USB, например, пишут: Inhibitors: Na (>0.2M), K (>0.2M) Сообщение было отредактировано Atropos - 23.10.2006 00:14 |
Atropos Постоянный участник abroad |
(Guest @ 21.10.2006 22:45) мне больше нравится выделять квайджиновским китом хотя промеговским или сигмовским тоже неплохо было У Эппендорфа и Сигмы так вообще есть пятиминутные киты. Прогресс идёт. |
curious67 Постоянный участник |
А что до хранения- не замечал, чаще всего плазмида идет на сиквенс, два дня, а дальше может, и не надо будет. Словом, тут ничего сказать не могу, но жалоб пока не было (от вторичных пользователей моих плазмид, к примеру) |
green mouse Участник Москва |
(Guest @ 21.10.2006 13:50) Я думал, яркость свечения на форезе зависит исключительно от количества пДНК, а не от метода, которым ее выделяли... я сначала тоже так думала, а потом мне кто-то сказал, что минипрепом оно столько не выделяется |
green mouse Участник Москва |
(curious67 @ 22.10.2006 00:43) еще Клонтеховкий неплох. Да все это одно и тоже, народ, о чем спорить? Я вот, не беру в руки лизоцим уже...лет эдак 10. И кто бы мне сказал, что плазмида плоха, не режется или не секвенируется, или еще что. А некоторые делают еще как-то. При этом жизнь все равно как-то идет вперед дайте денег! дайте мне много денег! Сообщение было отредактировано green mouse - 23.10.2006 19:18 |
curious67 Постоянный участник |
Сообщение было отредактировано curious67 - 24.10.2006 09:59
|
Atropos Постоянный участник abroad |
P. S. В итоге пришёл к выводу, что нужно просто посильнее/посмелее трясти при перемешивании и перед ЦФ. =) Сообщение было отредактировано Atropos - 12.10.2007 22:35 |
curious67 Постоянный участник |
|
Alexkiev |
|
guest: Студент IP-штамп: fr4MbcymAiCcU гость |
« 1. + 100µl 2М AcONH4, вортекс 20''; 2. NT, 5'; » «Устранение большей части рибосомной RNA. В высокой соли одноцепочечная RNA образует большие ассоциаты (может быть за счет случайной гибридизации) и не растворяется.» Убрать образцы на -20 и продолжить выделение на следующий день. :confused: А то я сначала сделал, потом подумал. :shuffle: :teapot: |
Atropos Постоянный участник abroad |
ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды; При желании и на этом этапе можно прерваться, т. е. бросить эппендорф с осадком, например, на - 70. Сообщение было отредактировано Atropos - 12.10.2007 22:45 |
Atropos Постоянный участник abroad |
(guest: Студент @ 10.08.2007 19:03) Уважаемые молекулярные биологи, скажите пожалуйста, можно ли останавливать процесс выделения плазмидной ДНК в данной методике в пункте 16: Убрать образцы на -20 и продолжить выделение на следующий день. А то я сначала сделал, потом подумал. Как-то раз так делал, когда рабочий день на кафедре неожиданно закончился , никаких отрицательных последствий не заметил. |
Atropos Постоянный участник abroad |
п.2. - ещё 2 раза; ЦФ 10'' дополнительно, отсосать остатки среды; Кстати, у кого какой опыт по поводу пользы дополнительной стадии ресуспендирования в р-ре I и осаждения (перед п. 5)? В Маниатисе в принципе рекомендуют The penalty for failing to remove all traces of medium from the bacterial pellet is a preparation of plasmid DNA that is resistant to cleavage by restriction enzymes. This is because cell-wall components in the medium inhibit the action of many restriction enzymes. This problem can be avoided by resuspending the bacterial pellet in ice-cold STE @.25x volume of the original bacterial culture) and centrifuging again. но сравнивать как-то лень всегда было, то делал, то нет, по настроению. На практикуме такую стадию вроде делали. |
Гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf. гость |
|
PPK Rattus |
Как я понял, их основной смысл - очистка от RNA. Может ли наличие RNA существенно ускорять полоску в геле (в 3-4 раза)? Когда мы пробовали с ними, под конец этой многократной очистки ИПСом осадка уже не было видно. Или так и должно быть? И, кроме того, в конце предлагается растворять в 25мкл буфера, но это сильно мало для последующей очистки фенолом-хлороформом (трудно отсасывать такие мелкие количества верхней фазы). Или после такой очистки можно сразу добавлять буфер для внесения - и в лунки? Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus - 21.12.2007 17:17 |
petr Постоянный участник |
Если выделять не китом (Кваген мидипреп пользую), то: 1. в раствор I сразу налить РНКазу (собсна Квагеновцы так и делают) 2. после инкубации в р-ре III (NaAc или NH4Ac) и открутки, супер надо отфенолить и отхлороформить (там же белков как грязи! потом после изопропанола хрен чего растворишь), и только потом осаждать. 3. после растворения осадка дополнительные очистки - по вкусу. 2 гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf: Ну да, для минипрепа вместо раствора 1 пользую воду. Для миди - не пробовал. |
PPK Rattus |
(petr @ 21.12.2007 23:43) в раствор I сразу налить РНКазу Обязательно? Какую? Сколько? Этого достаточно, чтобы убрать всё, что помешает форезу?Сообщение было отредактировано [PPK] Rattus - 22.12.2007 08:07 |
petr Постоянный участник |
|
curious67 Постоянный участник |
Итак, записывайте: 1) крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс, 60-75 сек 2) ресуспендируем в растворе 1 (300-400 мкл 10 мг/мл раствора РНКазы на 10-12 мл по фиг чего, допустим, 20 мМ Трис или РВS)- 250 мкл 3) добавляем 250 мкл раствора 2 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли 4) 350 мкл 3 М КAc рН 4.8-5.2 (3М по К, 5 М по ацетату- по Маниатису). Интенсивно перемешиваем переворачиванием пробирки (не вортекс!) до образования творожистой взвеси. раствор уже не вязкий. 5) крутим 10 мин на макс 6) переносим все 850 мкл в 700 мкл изопропа, перемешиваем на вортексе хорошенько 7) 10 мин на макс 8) Имеем компактный осадок, размер которого зависит от: а) от копийности плазмиды, б) от наличия или отсутствия РНК. Изопроп удаляем, остаточное его количество коротко сбрасываем на минифуге и до-отбираем досуха 9) Промываем (здесь аккуратнее- изопропные осадки можгут отделяться от стенки) 80% этанолом, произвольное количество, спирт удаляем, остатки его- также на минифуге и до-отбираем досуха 10) СУШИМ 5 МИН НА 42-44 оС 11) растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0. Все Количество для нормальных плазмид типа pBlueScript или pGEM- 200-500 нг/мкл и выше, для менее копийных типа pQE или pET -от 50 нг/мкл и выше Качество- аналитическая рестрикция и сиквенс- ОК, для количественной рестрикции , трансфекции- надо фенолить На форезе- иногда много суперкойла, иногда в основном релакс, что ни хорошо и ни плохо. При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить Вот и все. Проще метода не бывает, воспроизводимость -100%, количества достаточные, траха- мин Сообщение было отредактировано curious67 - 26.12.2007 14:09
|
Ъ IP-штамп: frWBxqPTDNeUI гость |
(curious67 @ 22.12.2007 22:01) Но ничего нового и принципиального... Но я все равно благодарю за то, что не поленились и высказались (эмоционально!). В любом случае полезно, не только для начинающих. |
petr Постоянный участник |
(curious67 @ 22.12.2007 20:01) 3) добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS), 5 мин при нежном перемешивании до полупрозрачной сопли 5мин многовато. Достаточно 2-х мин. Вообще клетки лизируются моментально, главное аккуратно перемешивать Все равно, после отбора супера (после высаливания, перед осаждением изо-, хотя я всегда осаждал этанолом) я б отфенолил/отхлороформил, тогда ничего греть не придется (кстати, однажды открутил чачу, которая не растворилась даже при кипячении, а при следующей открутке, супер на форез -> шмер). В остальном - это ж классика, когда нет кита под рукой. Сообщение было отредактировано petr - 23.12.2007 04:14 |
petr Постоянный участник |
(petr @ 22.12.2007 05:52) Да, до работы сегодня так и не добрался. Но что-то у меня в голове крутиццо - стоковый раствор РНКазы 10мг/мл, конечная концентрация 10мкг/мл. Возможно вру, как буду в лабе посмотрю. Кстати, если растворяете сухую РНКазу, добавьте к ней немного EDTA (этак 10мМ чтоб было) и прогрейте этак на 80оС минут 10-15. Она всегда загрязнена ДНКазой. Странно, но РНКаза вроде не боится кипячения, но почему-то однажды я вскипятил ее, и она сдохла... Сообщение было отредактировано petr - 23.12.2007 04:20 |
curious67 Постоянный участник |
|
PPK Rattus |
А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает. А если на 12 тыс. 2' можно? >добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS) Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ? >КAc А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету... >на макс В смысле на максимуме оборотов? >При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить А без РНКазы точно никак для фореза? >растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0 А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает? |
curious67 Постоянный участник |
([PPK) Rattus,26.12.2007 13:19] >крутим 2 раза по 2 мл (можно 1 раз, будет в 2 раза меньше ДНК) ночнушку на 10 тыс А 3 раза по 1,5мл можно? А то в эпендорф больше не влезает. А если на 12 тыс. 2' можно? Ответ: во-первых, 1,5 мл пробирки менее удобны, ибо дно заужено и перемешивание плохое, особенно в вязкой среде после добавления щелочи во-вторых, 12 тыс нельзя, клетки полопаются. И 2 мин не надо, 60-75 сек на 10 тыс. вполне достаточно >добавляем 250 мкл раствора1 (стандартная NaOH-SDS) Вы, наверное, хотели сказать "раствора2" ? Ответ: спасибо, уже исправил >КAc А AcONH4 не сильно хуже? А то ацетеата калия у нас вроде нету... Ответ: Аммонийных солей надо намного больше, если не ошибаюсь, 1/3 от объема- было как-то в древних методах. Все же надо б найти калий, это пустяк >на макс В смысле на максимуме оборотов? Ответ:- разумеется >При наличии большого кол-ва РНК (в случае экспрессионных плазмид) можно добавить равный объем раствора 1 , проинкубировать мин 5-10 на 37 оС, и фенолить А без РНКазы точно никак для фореза? Ответ: РНК вообще-то ничему не мешает, но этидий на себя сосет, и если РНК много, то ДНК (идущая сверху) недокрашивается- можно сильно недооценить ее (ДНК) количество со всеми вытекающими... >растворяем в 50-70 мкл 5 мМ Трис рН 8.0 А трудоемкость с феноленьем таких небольших количеств не возникает? Ответ: Если фенолите, то разбавьте раза в 2, потери будут меньше. А если не фенолить, то 50-70 мкл- как раз тот объем, которые даст Вам удобные концентрации плазмиды для последующих манипуляций Сообщение было отредактировано curious67 - 26.12.2007 14:09
|
PPK Rattus |
Что-ж делать, чем богаты, тем и рады... :[ >12 тыс нельзя, клетки полопаются. Но их же всё равно потом лизировать? >А если не фенолить Для неколичественного фореза необязательно? |
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |