 * |   |
|
Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда |  Zbio-wikiNG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: |
|
Правила
* PAAG электрофорез белков -- comments to a permanent page of the site --
Тема связана с: SDS PAAG
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.
   |
 Pavel2Участник  |
 27.12.2006 19:42
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
27.12.2006 19:52
Если это SDS форез, то НУЖНО!!! |
|
Guest IP-штамп: fra6xdMWXgbHc гость |
28.12.2006 09:35
(Pavel2 @ 27.12.2006 18:06)  Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?ну если в буфере есть мочевина, то конечно не надо. |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
28.12.2006 11:51
А вот хрена вам лысого!!!! Трис который выходит в верхний гель он не из нижнего буфера, а из геля и его количество в нижнем буфере, компенсируется не глицином из верхнего буфера, а хлоридом из геля. А потерянный глицин остается в геле, который вы извлекаете из камеры. ---Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались? Скажем так денатурация это средство, с помощью которого увеличивается и стабилизируется процент связанного с белком SDS. Но то что при кипячении белки денатурируют. Биофизический фахт. Если вас волнует проблема того, что при денатурации белок может потерять антигенную детерминанту. То это вопрос филозовский - может потерять, а может и не потерять. К тому же блотированный на мембрану белок частично ренатурирует. Востановится ли при этом АГ детерминанта тоже вопрос филозовский. Короче, в вашем случае, если антиген покрасился, то все хорошо, а если не покрасился это еще не значит, что его там не было. Нужн иммунохроматография или иммуноперципитация для полной у уверенности. |
|
Pavel2 Участник |
15.01.2007 13:24
Какая здесь разница? |
|
guest: ммм IP-штамп: frHvyGooYAnV2 гость |
15.01.2007 13:48
МОНА!!! ---Какая здесь разница? а) ДТТ можно класть в два раза меньше чем МЭ по молям. б) ДТТ раз в 10 или больше дороже чем МЭ в) ДТТ менее летучь, менее вонючь, менее токсичен, не требует вытяжки. |
|
Гость IP-штамп: frtbMasbqESIo гость |
13.02.2007 13:30
|
|
Гость IP-штамп: frNgDO7rvIshI гость |
05.03.2007 12:12
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
05.03.2007 14:20
По рН акриламидного стока можно приблизительно контролировать качество акриламида. Измерять лучше по бумажке. При гидролизе акриламида образуется акриловая кислота и аммиак, последний, как более летучий частично уходит из раствора. Поэтому гидролизовавшийся раствор обладает некоей дополнительной кислотностью но рН чистой воды обычно может доходить до 5.2-5.5 поэтому если вы использовали деионизированную воду о плохом акриламиде будет говорить рН ниже 5-4.5 на диститлляте ниже 5. Но честно говоря это очень приблизительный метод и выдает информацию, если уж акриламид полное дерьмо, хуже чем квалификации реагент. |
|
Гость IP-штамп: frNgDO7rvIshI гость |
05.03.2007 14:26
|
|
Guest IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
05.03.2007 17:18
По бумажке или по рН метру? Просто 30% АА там уже воды мало и рН уже не совсем тот, что в чистой воде. Индикатор этому подвержен меньше чем рН-метр. А вообще подозрительно, типа АА, кто-то подтитровал или забуферил. Еще варианты: не очень чистая вода. А вообще, если форез симпатичный, то я бы не заморачивался. У идеального АА рН раствора должен совпадать с рН воды, в которой его растворили. |
|
Гость IP-штамп: frNgDO7rvIshI гость |
05.03.2007 18:26
Если бы все тип-топ, не заморочился бы никто, естественно. |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
06.03.2007 14:54
2) Проверте рН воды в которой растворяли сток АА 3) Померьте рН стока АА по индикаторной бумажке. 4) Не делайте ничего из 1-3, а вместо этого, добавте в сток АА деионизирующей смолы дауэкс. Причины паршивого фореза: полохой АА, плохой Трис, плохой Глицин. Плохой рН. Плохие пробы (мало кипяченые, мало SDS, много соли или не тот рН в пробах) |
|
Танаит |
06.03.2007 15:29
Ладно, будем искать. Спасибо всем за подсказки |
|
Гость IP-штамп: frHWt7eplAB5c гость |
07.03.2007 07:22
|
|
Nastasya Участник |
28.03.2007 11:59
|
|
accelerant Постоянный участник Europe & Russia |
31.03.2007 12:52
(Гость @ 07.03.2007 14:22) у меня протеан 2 большой, помогите пожалуйста приготовить растворы белков для фореза, точнее как смешать образцы белков c sample буфером, сколько мкг белка надо взять и на сколько мкл, такая проблема: я наношу белки, а разделения нет после фореза, и сколько Вольт и амперы нужны при форезе, я новичок - обьясните простым языком... заранее спасибо, жду ответа срочноИногда все же полезно научиться излагать свои мысли связно.. |
|
Гость IP-штамп: fru928dN3/GhE гость |
06.04.2007 14:05
|
|
Сергей Васильевич |
06.04.2007 14:14
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
06.04.2007 15:36
Точно не помню жираф большой, около 500-600кДа это нативный в конце концов можно в Генбанке уточнить. или методику его выделения из селезенки если такое возможно. Такое возможно, а методики нужно искать в первоисточниках. |
|
bukach Постоянный участник Geneva, Switzerland |
06.04.2007 18:49
(Сергей Васильевич @ 06.04.2007 14:14) Подскажите молекулярную массу ферритина свиньи, или методику его выделения из селезенки если такое возможноа) базы данных, например вот что он про ферритин пишет. если пойдете по ссылкам, то там помимо его а.к. последовательности обнаружите еще и ссылки на статьи по выделению б) еще PubMed не бесполезен в подобных разысканиях |
|
Гость IP-штамп: frmkz51JvFK6w гость |
18.05.2007 15:44
Уже испробовали все, что могли! После прокраски таинственно исчезают все белки до 70 кДа. Причем в концентрирующем геле их нет ?! |
|
Dmitry Molotkov |
25.06.2007 13:14
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
26.06.2007 18:19
Уже испробовали все, что могли! После прокраски таинственно исчезают все белки до 70 кДа. Причем в концентрирующем геле их нет ?! опишите протокол окраски. С составами растворов. Похоже они у вас вымываются либо фиксация, либо окраска хромают. |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
26.06.2007 20:22
Принцип описан у Остермана в электроферозном томе. Самый топорный вариант два стакана и две U-образные трубки с длиной рук не меньше чем высота стакана(трубки должны иметь кран или любое устройство отсекающее поток в них. Два стакана соединяются одной трубкой(как сообщающиеся сосуды) из одного из стаканов второй трубкой делается слив. В стакан со сливом помещается магнитный мешальник, конструкция водружается на магнитную мешалку. Сливную трубку соединяют с резервуаром в котором собираются сотворить концентрационный градиент. Готово дело. Сделать можно из двух бакпечаток. Или баночек на их основе. В одной баночке у самого дна в цилиндрической стенке делается отверстие по диаметру чуть больше чем стержень от шариковой ручки, в другой делаются два таких отверстия одно напротив другого(как бы лежащие на противоположных концах диаметра). В каждое отверстие вставляется по отрезку от трубочки стержня шариковой ручки для того что бы стержень герметично зафиксировался в отверстии на отрезок трубочки одевают уплотнительное резиновое колечко(например из нипельной велорезины или тонкой силиконовой трубки). У вас должно получится две емкости со сливными трубочками снизу - у одной - одна, у другой - две. Теперь с помощью тонкой резиновой трубочки(силикон) надо соединить одну емкость с другой. Трубочка должна быть такой длины, что бы ее можно было легко пережимать каким-нибудь зажимом. У вас должно получится два сообщающихся сосуда, пермычку между которыми вы можете перекрывать зажимом. У одного из сосудов должна остаться еще одна сливная трубочка. К этой трубочке надо так же подсоединить тонкую резину, в конец которой вставлен тонкий типик от автоматической пипетки или игла от шприца. Эта сливная трубочка тоже должна иметь возможность перекрываться зажимом. Все! Теперь осталось сделать магнитный мешальник из обрезка гвоздя запаянного в туже трубочку от стержня шариковой ручки. Хэнд мэйд градиент готов. Вместо баночек можно использовать шприцы или пробирки с плоским дном. Другой продвинутый вариант делается из двух толстых блоков орг стекла. Толщина 30-40мм и где то 85х85(150х150) мм размером В одном рядом друг с другом паралельно в торце делаются два сквозных отверстия подходящего диаметра(15-20мм)(прообраз все тех же сообщающихся сосудов) высота(глубина) подбирается в зависимости от объема градиента, но выше 150мм не надо. В торце другой заготовки примерно по центру делается глухое толстое отверстие диаметров от 8-12мм и глубиной мм 50-75 - это основа будущего цилиндрического крана. Расстояние от глухого конца отверстия до ближайшего торца блока должно быть мм на 5 больше чем диаметр сообщающихся сосудов. Теперь в заготовке с глухим отверстием надо сделать два масеньких отверстия лежащих на одной линии и перпендикулярно плоскости заготовки в глухое отверстие( так сказать перпендикулярно оси глухого отверстия и вдоль оси этого глухого отверстия (те как бы отверстия в стенке глухого отверстия). Второе требование к этим отверстиям расстояние между ними должно быть таким, чтоб если к ним приложить заготовку с сообщающимися сосудами(осями сосудов перпендиколярно плоскости второй заготовки, образуя подобие тавра), то оба маленьких отверстия попадают каждое в свой сосуд при этом один из сообщаюшихся сосудов краем своего дна должен обязательно попадать за пределы глухой стенки глухого отверстия. Теперь в заготовке с глухим отверстием делается третье масенькое отверстие не сквозное, а глухое, на той же линии, что и первых два, но уже за глухой стенкой, оно должно быть на таком расстоянии от ближайшего, что бы они оба оказались в пределах дна одного из "собщающихся" сосудов в другой заготовке. При прикладывании заготовки с сообщающимися сосудами к заготовке с глухим отверстием, два маленьких отверстия, попадающих в стенку глухого отверстия должны попадать в дно двух разных "сообщающихся" сосудов, а маленькое глухое отверстие должно быть в пределах дна оного из "сообщающихся" сосудов. Теперь если маленькие отверстия поставить вертикально, то в горизонтальном направлении надо от ближайщего торца заготовки просверлить отверстие соединяющее дно маленького глухого отверстия с торцом заготовки - это аналог сливного канала(Г-образный канал). Теперь осталось изготовить кран, который представляется из себя стержень из оргстекла или тефлона ответный глухому отверстию те соответствующий ему по диаметру(на пару тройку соток меньше) и чуть длинней, чтоб было за что крутить, стержень нужно снабдить воротком или рычажком, с помощью которого его можно вращать в отверстии. В боковой поверхности стержня выфрезеровывается продольная проточка по ширине равная диаметру масеньких отверстий в стенке глухого отверстия, а длинной точно совпадающая с расстоянием между наиболее удаленными краями этих отверстей(глубина особого значения не имеет). Эта проточка таким образом образует канал соединяющий эти два масеньких отверстия, когда стержень(кран) вставлен в глухое отверстие(получаются сообщающиеся сосуды), если кран повернуть, то эти отверстия разъединятся(сосуды разобщаются). Ну теперь приклеиваем первую заготовку с сообщающимися сосудами ко второй, так чтоб в одном сосуде было одно отверстие, а в другом два одно с краном, а другое сливное, присоединяем к сливному шланг с зажимом и наконечником. Все. Если вы чего-нибудь поняли, то с вас пиво, если не поняли, то пиво в двойне. Честно, нельзя такие вопросы в форуме задавать это надо рисовать и показывать. Отдельного труда стоит. Это просто у меня сегодня отходняк от защиты дипломов вот я и растекся словом по монитору |
|
Ъ IP-штамп: frWBxqPTDNeUI гость |
26.06.2007 22:44
|
|
Dmitry Molotkov |
27.06.2007 09:36
|
|
Гость IP-штамп: fr7/T.o4fBiy6 гость |
10.11.2007 00:34
|
|
Guest IP-штамп: frNFBHcL2JSwo гость |
10.11.2007 01:28
|
|
Гость IP-штамп: fr7/T.o4fBiy6 гость |
10.11.2007 03:08
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
10.11.2007 16:58
Причина отход геля от стекла. Это у вас либо плохой набор(прокладок) разброс по толщине гребенки и боковых прокладок, либо грязное стекло. Либо когда вынимаете гребенку очень сильно механически воздействуете на стекла блока. |
|
Guest IP-штамп: frPanb9Lvzu1g гость |
10.11.2007 20:31
Насчет отслоения геля - если это происходит из-за излишних "усилий", то легче вынимать гребенку, закапав вдоль гребенки воды или буфера - так, чтобы в пустые лунки входила жидкость, а не воздух. |
|
guest: Vasyl IP-штамп: fr39I8Nrrb2K2 гость |
15.11.2007 07:07
(guest: ммм @ 10.11.2007 16:58) Это у вас либо плохой набор(прокладок) разброс по толщине гребенки и боковых прокладок, либо грязное стекло. Либо когда вынимаете гребенку очень сильно механически воздействуете на стекла блока. Не, стекла мытые -> сполоснутые дистиллятом ->70% этанолом. А насчет системы - чем богаты тем и рады, MiniProteanII from Bio-Rad. Может, попробовать что-нибудь в гель добавить, чтоб он лучше к стеклу прилипал? Известны ли современной науке такие весчества? Кроме клея для стекла? |
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
15.11.2007 13:26
И грязные.  -- А насчет системы - чем богаты тем и рады, MiniProteanII from Bio-Rad. Ну раз богаты, то радуйтесь. Закажите новые стекла и будет вам счастие. Или лучше напишите рекламацию: "Мол гавно у вас система, стекла, типа, в горячей хромке не помыть, потому что тут вашим прокладкам и кирдык наступит. У вас, например могли, попортится прокладки, а они часть стекла, так что от смены стекла никуда не деться. --Известны ли современной науке такие весчества? Кроме клея для стекла? Ага! Алилтриэтоксисилан - обрабатывать надо стекло, но после этого гель к стеклу приторчит КОВАЛЕНТНО.
|
|
polly |
15.11.2007 19:39
|
|
comp3v Постоянный участник Москва |
15.11.2007 19:42
(polly @ 15.11.2007 18:39) Ребята, разъясните мне безграммотной, как приготовть трис-Сl ph 8,8 и 6,8 которые используют в белковом форезе? В прописях на сайте найти не могу |
|
polly |
15.11.2007 19:52
(comp3v @ 15.11.2007 17:42) а в чём непонятность-то? готовится обычный трис (1M или 1,5M), перед "доливанием" до конечного объёма доводится pH до нужного значения - и всё, собсноЧто то это мне картину никак не происнило , Скажите сколько чего сыпать 
|
|
comp3v Постоянный участник Москва |
15.11.2007 20:01
сколько сыпать - зависит от того, что у Вас есть. Посмотрите на банке с трисом (я не знаю, что там у вас - Trzima base или ещё чего), какая у него молекулярная масса. Определитесь, какой объём хотите. Ну и сыпьте, соответственно, m[г]=Mw[г/моль]*V[л]*с[моль/л] |
|
polly |
15.11.2007 20:04
|
|
comp3v Постоянный участник Москва |
15.11.2007 20:06
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
15.11.2007 20:06
Если кратко то взвешивате основание трис чтоб получалось по молярности на нужный объем. Растворяете в обьеме меньшем раза в 2, полтора, потом подтитровываете концентрированной солянкой на рН-метре и доводите водой до нужного объема. Ну, есть тонкости, имено, с трисом, его лучше до обема не доводить а дать денек постоять, потом еще раз подтитровать, а потом только подводить объем. |
|
polly |
15.11.2007 20:19
Спасибо Вам огромное, уважаемый "guest: ммм " Все стало понятно, только я вот не знаю какой моляльности должен быть трис, В описании белкого фореза в приготовлении растворов фигурирует просто tris-Cl pH 8,8 и 6,8 |
|
Tom1 Постоянный участник |
15.11.2007 20:41
или посмотрите раздел "методы" на данном сайте там тоже прописи есть..... |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
15.11.2007 20:55
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
16.11.2007 13:54
Ну для этого нужна табличка. И два реактива вместо одного (ибо HCl стоит дешевле дистиллята). Да и с навесками там не тривиальный расчет нужен будет чтоб молярность по трису сохранить. Но если нет рН-метра, то только так и делать иначе никак. |
|
Ъ IP-штамп: frNwv0U1khjS. гость |
16.11.2007 18:38
,пардон). А кому нужны сотые доли рН ?, ну тогда можно и рН-метр завести. Себестоимость ниже. если с учетом затрат времени и полученных эмоций. 
|
|
Guest IP-штамп: frPanb9Lvzu1g гость |
16.11.2007 20:38
(guest: Vasyl @ 15.11.2007 07:07) Может, попробовать что-нибудь в гель добавить, чтоб он лучше к стеклу прилипал? Известны ли современной науке такие весчества? Кроме клея для стекла? - если в концентрирующий гель добавить diallyltartardiamide вместо бисакриламида, то гель получается очень "пластичный" и образцы не перетекают. Правда, из-за пластичности (если начистоту, то "сопливости" ) геля гребенку лучше извлекать, добавляя вдоль гребенки чтобы вместо воздуха входил, буфер - или даже просто под струей воды, иначе ячейки получатся кривые, и столбики придется выравнивать иглой
|
|
guest: ммм IP-штамп: frwHRv5zEzGDY гость |
16.11.2007 21:38
Нет, только если смешивать растворы. Если по сухому весу делать надо либо пресчитывать объемы на 100мл по сумме и высчитавать потом навески, либо высчитывать объем по табличке как сумму объемов растворов и тогда его нужно доводить в мерном цилиндре, что не всегда удобно. -- на сайте Sigma Сайт может быть просто недоступен из-за отсутствия связи. Так что табличку придется не только найти, но и распечатать, заранее подготовившись, и взять с собой. --Но затраты времени несравнимы, а также не контактируешь с конц. НС1 если взвешивать сравнимы. Если бороться с солянкой, то тогда от акриламида, надо просто в обморок падать. --Себестоимость ниже. если с учетом затрат времени Затраты времени стоят очень по разному в США, России и Китае, например. --и полученных эмоций. Это вообще вещь субьективная Кроме того солянокислый трис, вроде дороже основания и при том еще в нем содержание основного вещества меньше. Ты платишь за лишний вес моля солянки, к каждому молю триса. Если ты заранее приготовишь растворы тебе никогда не сделать трис концентрированей твоих исходников. А например 3М трис рН 8,8 вообще таким способом(слиянием растворов не сделать, 3МТрис основание просто не растворяется в воде), а подтитровкой он делается. |
|
Гость IP-штамп: frG/ehwVgdnf. гость |
19.11.2007 12:22
|
|
polly |
30.11.2007 16:18
|
| « Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |
 |
· Викимарт - все интернет-магазины в одном месте · Доска объявлений Board.com.ua ·
--- сервер арендован в компании Hetzner Online, Германия ---
--- администрирование сервера: Intervipnet ---
Хеликон · Диаэм · ИнтерЛабСервис · Beckman Coulter · SkyGen · ОПТЭК · BIOCAD · Евроген · Синтол · БиоЛайн · Sartorius · Химэксперт · СибЭнзим · Tecan · Даниес · НПП "ТРИС" · Биалекса · ФизЛабПрибор · Genotek · АТГ Сервис Ген · Биоген-Аналитика
Powered by Invision Power Board(Trial) v2.0.0 © 2025 IPS, Inc.