molbiol.ru -> PAAG электрофорез белков

> Все форумы > Тематические форумы > Молекулярная и клеточная биология

Zbio-wiki

NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ

Правила FAQ* Поиск* Участники* Календарь* Избранные темы* Форум Форумов*

Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ]

Форум:

* PAAG электрофорез белков -- comments to a permanent page of the site --

Тема связана с: SDS PAAG
Операции: Хочу стать куратором* · Подписаться на тему* · Отправить страницу по e-mail · Версия для печати*
Внешний вид:* Схема · [ Стандартный ] · +Перв.сообщ.

страницы (10): 1 2 3 > »

Forum robot
Постоянный участник
на сервере в Москве

12.12.2005 13:24

URL #1

Комментарии к постоянной странице сайта: PAAG электрофорез белков

Приготовление полиакриламидного геля и электрофорез белков. Выбор % разрешающего геля. Подготовка форезного аппарата. Форез. Хранение гелей.

Fibrinolysis
Участник
Земля

12.12.2005 13:24

URL #2

Хотелось бы уточнить для тех кто делает в первый раз, что pH пятикратного TGB доводить до 8.3 не нужно!

Fibrinolysis
Участник
Земля

12.12.2005 15:10

URL #3

В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3

0xy
Участник

12.12.2005 15:22

URL #4

Laemmli, U.K.

atv
IP-штамп: frYbYLePaIpgo
гость

13.12.2005 03:26

URL #5

А вот вразумите всё-таки, можно ли сделать готовый раствор для геля (т.е. всё кроме APS+TEMED) и его хранить (в холодильнике, например)? И как долго?

Batareykin
Постоянный участник
пожизненный ЭЦИХ с гвоздями

13.12.2005 08:23

URL #6

(atv @ 13.12.2005 00:26)

конечно, можно.
Я для своих целей и 15 % разделяющего, и концентрирующий так держу в холодильнике.

только долго хранить его не стоит (более 1 года

) - протухаеть...

Batareykin
Постоянный участник
пожизненный ЭЦИХ с гвоздями

13.12.2005 08:24

URL #7

(Forum_robot @ 12.12.2005 10:24)

<strong><font color='#800000'>Комментарии к постоянной странице сайта</font>: PAAG электрофорез белков</strong>

Приготовление полиакриламидного геля и электрофорез белков. Выбор % разрешающего геля. Подготовка форезного аппарата. Форез. Хранение гелей.

бедный робот...

_a_jadan_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 20:00

URL #8

к п 5,8 дегазировать можно как вакуумом, так и продувкой азотом, или инертными газами (гелий), главное избавиться от кислорода, причем продувка быстрее и эффективнее, пузырек с раствором закрывается резиновой пробкой с двумя иголками, конец одной на дно, другой под крышкой, к длинной игле камеру (от мяча, шарик) с азотом (или балон, через редуктор) поток - чтоб еле булькало. (несколько минут и готово) не нужен ни насос, ни мешалка.

_Pedro77_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 21:10

URL #9

Чтоб избежать размывки трэков при внесении проб с высоким содержанием соли либо с ПАВ, полезно с двух боков в лунки нанести чистый буфер для образцов (который добавляли в пробы перед кипячением). Часто это помогает получить более-менее не размытую картинку.

Поблагодарили (1): Feodor

_Dascha_
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 21:37

URL #10

Собственно, готовые SDS-гели можно хранить и при комнатной температуре, предварительно поместив во что-то влажное, например, фильтровальную бумагу, и не давать им высыхать. ДТТ мы храним на -20 сколько угодно, и он не портится.
Например в Германии 10% персульфат аммония принято в виде раствора хранить в морозильнике, хотя принято делать его всегда свежим. Но, видимо, немецкая практика оправдана, потому что гели получаются, сама их заливала.

Гость
IP-штамп: frftLGqhpFF.A
гость

11.01.2006 21:47

URL #11

Уважаемые есть еще такой момент что уж еще раз вспоминая Остермана хочу отметить что ПСА лучше добавлять в растворгеля в последнюю очередь.А с рибофлавином такая штука , он конечно хорош, но летом в холодной лаборатории без света полимеризация занимает гораздо большее время с ним чем с ПСА. И еще просьба вы пишете про выбор концентрации гелей относительно массы белка. Будет лучше если вы еще напишете список этих самых белков с их массами. начинающим будет удобней.

comp3v
Постоянный участник
Москва

15.01.2006 03:01

URL #12

хм... а мы вот 10% APS и вовсе на +4 храним, и довольно долго - работает без проблем.

Николай Полянский

20.02.2006 14:49

URL #13

Коллеги, хотелось бы знать, м.б. кто-нибудь имел дело с разделением водонерастворимых белков. Проблема такая - образец белков, растворенных в мочевине и тиомочевине и после соответственно кипячения в синем буфере и разделения дает очень расплывчатую картину. Много хуже картины водорастворимых белков. В сам буфер мочевину не добавляю.

Поблагодарили (1): mdulya

ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

20.02.2006 15:15

URL #14

2 Николай Полянский.

Общая рекомендация такая. Мочевину и ее тио подругу из раствора удалить начисто(например диализом), белки конечно в осадок выпадут, но это не должно вас пугать. Сей осадок надо собрать и как следует покипятить в "синем буфере", белки конечно полностью не растворятся, но львиная их доля растворится, пробу надо отцентрифуговать и отобрать супер его и использовать как пробу.

PS мочевина мешает связыванию SDS с белком, и когда белки выходят из мочевины в SDS то часть из них выпадает в осадок(особенно, если белки сильно нерастворимые и в высокой концентрации) и получаются хвосты.

Garry

20.02.2006 16:16

URL #15

Полянскому Н. > Мы занимаемся анализом гибридности семян (кукурузы, подсолнечника, ячменя ....). Короче почти все объекты - проламины, за исключением гелиантина подсолнечника. Так вот, если SDS электрофорез не является для Вас критичным, то мы проводим электрофорез в среде таких детергентов как мочевина. Она входит и в состав буфера для растворения и в состав геля. Результаты получаются очень неплохие. Если нужно подробнее, то пишите мне на мейл.

Поблагодарили (1): mila-belchik

Гость
IP-штамп: frTlWdNmzlEpc
гость

22.02.2006 11:02

URL #16

Спасибо. Очевидно, попробую оба варианта.

Guest
IP-штамп: fr3PpYUagJAXg
гость

22.02.2006 12:33

URL #17

To: Garry
Мочевина - НЕ ДЕТЕРГЕНТ (т.е. не является "омыляющим" веществом, способным образовывать мицеллы в растворе), а ХАОТРОПНЫЙ АГЕНТ.

Гость
IP-штамп: frW6PQ8r6IMNg
гость

01.06.2006 12:49

URL #18

Уважаемые коллеги! Поделитесь опытом извлечения белка из ПААГ блока или его фрагментов так, чтобы можно было посчитать С14-радиоактивность в полосках белков (разумеется, они будут вырезаны)

Заранее благодарим.
С наилучшими пожеланиями,
snz@post.nsu.ru

comp3v
Постоянный участник
Москва

03.06.2006 18:03

URL #19

а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?

Tom1
Постоянный участник

04.06.2006 02:57

URL #20

проще взять аликвоту и высадить тху.....

bukach
Постоянный участник
Geneva, Switzerland

05.06.2006 18:40

URL #21

(comp3v @ 03.06.2006 19:03)

совсем. гуанидин, в отличие от мочевины, заряжен.

comp3v
Постоянный участник
Москва

05.06.2006 18:50

URL #22

ну да, я просто как-то раз наткнулся на протокол, где его добавляли - в небольших количествах, но гнать потом приходилось на очень маленьком токе.

А вот тогда скажите лучше - что именно выпадает в осадок при добавлении Laemmli к пробе, содержащей GuaCl? Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт? (но если брать избыток SDS, то может, и прокатит?...)

comp3v
Постоянный участник
Москва

05.06.2006 18:55

URL #23

да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?

ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

06.06.2006 15:45

URL #24

---Я так понял, что SDS, но в комплексе с чем? если с гуанидин-анионом, то нельзя ли таким макаром высадить весь гуанидин из пробы, или наш белок при этом тоже весь в осадок уйдёт?

Если это так то можно, но тогда существует опасность, что и часть белка попадетв этот осадок.

---да, и ещё, вдогонку - а когда в гель добавляют мочевину - нельзя ли таким образом "компенсировать" гуанидин в пробе (чтобы миграция шла нормально)?

Подумайте хорошенько и поймет, что нельзя.

Поблагодарили (1): bukach

atv
IP-штамп: fr4RLg76Oofjo
гость

16.07.2006 13:45

URL #25

расскажите, пожалуйста, для чего при форезе часто берут вместо второго стекла белую пластину (как она, кстати, правильно называется? алюминий-оксидная?) чем это лучше?
и можно ли этот материал где-нибудь самому достать или купить подешевле? а то покупать фармациевский комплект очень уж долго и дорого...

Utcn
Постоянный участник

17.07.2006 12:14

URL #26

Это керамика с высокой теплопроводностью - для лучшего охлаждения геля. ИМХО, на фиг не нужна...

Alder
Постоянный участник

18.07.2006 20:03

URL #27

"а вот такой вопрос возник. У меня есть лизаты в гуанидиновом буфере (6M GuaCl, для последующей очистки на Ni-резине), и в идеале хотелось бы аликвоту оттуда брать на вестерн. Брать "прямо так" - однозначно не получается (при миграции получается жуть, тем более что наносить приходится довольно много, поскольку белок сильно разбавлен). Но я вот тут почитал, что некоторые мочевину добавляют прямо при приготовлении геля, и подумал - а нельзя ли такое же и с гуанидином сделать? то бишь, добавить его в сам гель... или это совсем дурная идея?"

если концентрации белка позволяют, то развести образец раз в 10 и можно гнать форез, полосы чуть-чуть будут размыты.
Иначе - метанол-хлороформом высадить, минут 5-20 дополнительных в зависимости от кол-ва проб

Сообщение было отредактировано Alder - 18.07.2006 20:03

Tom1
Постоянный участник

18.07.2006 22:03

URL #28

Алдер имхо тупо и храбро тху - все.....

Гость
IP-штамп: frdk4fFh7od4A
гость

16.08.2006 08:22

URL #29

Такой вопрос: При кипячении образца в синем буфере образуется углеводная пробка. Как от нее избавится? Говорят, что надо добавить А-амилазу, тогда в какой концентрации, и можно ли ее чем либо заменить?

Гость
IP-штамп: frqXZNuewKQBA
гость

26.09.2006 17:45

URL #30

Ребята, помогите плиз
столкнулась с проблемой: покупаю бисакриламид, мне предлагают диакриламид. есть ли качественная разница (в количестве сшивок и т.д.) между бисакриламидом и диакриламидом?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

27.09.2006 19:05

URL #31

диакриламид очень сомнительное название. Возможно это димер акриламида, так этот супчик вообще сшивок давать не будет. А то что бисакриламидный аналог без метиленового мостика по идее должен содержать в своем названии слово гидразид и по большому счету довольно экзотичное соединение по сравнению с бисом.

Гость
IP-штамп: frTlWdNmzlEpc
гость

17.10.2006 14:05

URL #32

Уважаемые коллеги, нет ли у кого-нибудь опыта "негативного окрашивания" геля с помощью ацетата цинка. Попробовал по описанной методике (Matsui et al.), но применbл не деионизованную воду, а обычный дистиллят. Успеха не имел. Если есть некоторые "хитрости", плз, поподробнее.
Николай Полянский

Гость
IP-штамп: frNYJZecF5GO2
гость

14.12.2006 13:07

URL #33

необходимо выделить белок из мышечной ткани рыбы, подвергшейся тепловой обработке, для дальнейшего проведения электрофореза на автоматической системе FastSistem, какой экстрагирующий раствор лучше применить

Гость
IP-штамп: frNYJZecF5GO2
гость

14.12.2006 13:07

URL #34

Pavel2
Участник

14.12.2006 18:43

URL #35

(Fibrinolysis @ 12.12.2005 12:10)

В классической работе Лэмли (Laemli,U.K., Nature,227, 680 (1970))
1x TGB = 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0,1% SDS pH=8,3

Помогите разобраться. Мне нужно приготовить 1 л TGB готового к применению (я так понимаю 1xTGB). Для этого я беру Tris-base 15.1g + Glycine 94g + 50 ml SDS (http://molbiol.ru/protocol/17_01.html#s1)
А как приготовить 50 ml SDS он в сухом виде. В стоке (кстати что это такое?) SDS 10%, значит нужно на 1 литр взять 100 г SDS?
Объясните пожалуйста поподробней, скажу сразу я не биохимик.

Tom1
Постоянный участник

14.12.2006 18:50

URL #36

СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....
Делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС
Соответственно сначала растворяите трис и глицин примерно в 900мл воды потом добалвяите 10% сдс и доводите до литра водой....

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

14.12.2006 18:59

URL #37

---СДС сухой сыпать в буфер себя не любить....

Хе-Хе в электродный я так не делаю не сыплю, а вот во второй раствор для плазмид частенько сыплю сухого. Бо его там в 10 раз больше надо.

--делаите 10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС

Истино так. И кстати я его из пипетки прямо в минусовую камеру, для экономии. В два раза меньше расход.

Pavel2
Участник

15.12.2006 00:54

URL #38

Спасибо за Ваши ответы.
Хотел еще узнать, я использую midi-камеру для электрофореза, мне 500 ml TGB хватит в качестве рабочего объема? И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О, добавляю 50 ml SDS (5g SDS+50ml Н2О) и довожу до 1L Н2О
Глицина не слишком много, половина упаковки приходится высыпать?

Сообщение было отредактировано Pavel2 - 15.12.2006 00:58

Guest
IP-штамп: fra6xdMWXgbHc
гость

15.12.2006 10:48

URL #39

я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.

Pavel2
Участник

15.12.2006 11:22

URL #40

(Guest @ 15.12.2006 07:48)

я делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды. а потом уже разводится до 1х.

До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

15.12.2006 14:35

URL #41

И еще, я все правильно делаю для приготовления 1L TGB?
Tris-base 15.1g + Glycine 94g растворяю в 900 ml Н2О!

НЕТ НЕ ПРАВИЛЬНО!!!! триса - 3г, глицина-14.4, SDS-1г или 10мл 10% на 1Л готового раствора.

---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
А вот это правильно!!!

guest: ммм
IP-штамп: frwHRv5zEzGDY
гость

15.12.2006 14:43

URL #42

---До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?

Что есть 10х SDS в этой фразе? Если вот это: "10% сток т.е. на 100мл воды 10г СДС", то "НЕ ДОПУСТИМ".

Masha11

16.12.2006 14:11

URL #43

что-то я не пойму цели? вам что нужно сдс получить чтоль однократный или все- таки тяжелый буфер??? если однократный тяжелый буфер, то наливаете 100 мл 10х и доводите до 1 литра водой. усё)

Pavel2
Участник

19.12.2006 15:33

URL #44

Я здесь ошибся "До 1х это допустим 100 мл 10хSDS+1000 мл воды?". Имел в виду 10хTGB.

Я вот еще что не понимаю.
В методике PAAG электрофорез белков дана таблица для приготовления TGB - Tris-base 15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?
А вот это тоже правильно?
---делаю трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.
Получается расхождения по глицину, это не принципиально?

guest: ммм
IP-штамп: frHvyGooYAnV2
гость

19.12.2006 16:00

URL #45

-- трис-глициновый буфер 10х: 144г глицина, 10г SDS, 30г Tris и до 1л воды.

Это правильно. Это исходная система так сказать из первоисточника.

---15.1g, Glycine 94g SDS 50 мл (сток 10%) на 1L. Я так понимаю это 5xTGB?

Это какая-то модификация с перегрузом по глицину 94 вместо 72.

Вообще говоря, количество глицина весьма принципиально. Но все очень критично, если глицина недоложить и менее критично, если переложить. Небольшой перегруз по глицину позволяет использовать один электродный буфер для нескольких форезов. В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.

Короче, модификация для бедных и ленивых.

Поблагодарили (1): RRRR

Гость
IP-штамп: frNYJZecF5GO2
гость

21.12.2006 12:10

URL #46

Люди добрые, отзовитесь у кого есть в лаборатории PhastSistema, для быстого электрофореза, бьюсь одна, не биохимик, освоила изоэлектрофокусирование, на очереди SDS-электрофорез и 2D-электрофорез, методик нет. Помогите

Гость
IP-штамп: fra6xdMWXgbHc
гость

27.12.2006 18:40

URL #47

В раствор для нанесения белка (gel loading buffer
) зачем добавляют Dithiothreitol, он также как меркаптоэтанол востанавливает дисульфидные связи?

Pavel2
Участник

27.12.2006 19:01

URL #48

->В процессе фореза из катодного буфера уходит часть глицина и приходит трис, соответственно отношение трис/глицин увеличивается, что есть плёхо, как я уже писал выше, некий запас глицина в исходном буфере позволяет использовать его повторно.
<-
А если слить весь буфер после фореза и перемешать отношение трис/глицин не выровняется заново?

Pavel2
Участник

27.12.2006 19:06

URL #49

Еще такой вопрос, буфер с белками перед нанесением на гель нужно кипятить чтобы белки денатурировались?

Tom1
Постоянный участник

27.12.2006 19:16

URL #50

1. В принципе да если не боитесь что белки "убежавшие" в нижний буфер Вам помешают поетому обычно фитровал после смешивания....
2. А это зависит от задачи.......

Кнопка "Транслит" перекодирует
текст из транслита в кирилицу.
Правила перекодировки здесь;
текст в квадратных скобках'[]'
не преобразуется.

Имя:

Отправка сообщений использует JavaScript операции. В вашем броузере не
установлено/отключено выполнение JavaScript программ. Используйте Netscape Navigator
или Internet Explorer (не ранее 3 версии); убедитесь, что выполнение JavaScript
программ разрешено в настройках вашего броузера.