Molbiol.ru | О проекте | Справочник | Методы | Растворы | Расчёты | Литература | Орг.вопросы Web | Фирмы | Coffee break | Картинки | Работы и услуги | Биржа труда | Zbio-wiki NG SEQUENCING · ЖИЗНЬ РАСТЕНИЙ · БИОХИМИЯ · ГОРОДСКИЕ КОМАРЫ · А.А.ЛЮБИЩЕВ · ЗООМУЗЕЙ Темы за 24 часа [ Вход* | Регистрация* ] Форум: | |
velekap |
|
R.J.Dio Постоянный участник |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
Epsilon Новосибирск |
- либо Ваша встройка не лигируется в Ваш вектор (несовместимые концы из-за непрошедшей рестрикции, как Вам говорили, либо проблемы с фосфорилированием 5' концов...), - либо встройка выкидывается из вектора после лигирования при репликации плазмиды. Разновидность этого варианта: негативная селекция против плазмид, содержащих встройку. Если Вы делали ПЦР с лигазной смеси и видели продукт, соответствующий лигированной плазмиде, то вероятнее второе объяснение. Опять же, белые колонии могут означать, что рамка гена LacZ всё же сдвинута остатками неудалённой встройки... Нам в подобных случаях помогало изменение ориентации встройки на противоположную, либо использование специального вектора без селективного гена и с терминаторами транскрипции по краям от полилинкера. Вы не секвенировали встройки в плазмидах из белых колоний? |
velekap |
(R.J.Dio @ 29.05.2014 11:02) размер гена ~1400 bp |
velekap |
(Epsilon @ 29.05.2014 18:58) Тут два варианта: - либо Ваша встройка не лигируется в Ваш вектор (несовместимые концы из-за непрошедшей рестрикции, как Вам говорили, либо проблемы с фосфорилированием 5' концов...), - либо встройка выкидывается из вектора после лигирования при репликации плазмиды. Разновидность этого варианта: негативная селекция против плазмид, содержащих встройку. Если Вы делали ПЦР с лигазной смеси и видели продукт, соответствующий лигированной плазмиде, то вероятнее второе объяснение. Опять же, белые колонии могут означать, что рамка гена LacZ всё же сдвинута остатками неудалённой встройки... Нам в подобных случаях помогало изменение ориентации встройки на противоположную, либо использование специального вектора без селективного гена и с терминаторами транскрипции по краям от полилинкера. Вы не секвенировали встройки в плазмидах из белых колоний? нет, не секвенировали. Насчёт изменения ориентации- делал лигазные смеси по sticky и blunt - на обоих ПЦР показал наличие встройки (правда, только перекрёстными праймерами, фланкирующие показывают отсутствие, хотя это может говорить, только о том, что плазмиды со встройкой просто очень мало почему-то). А почему при репликации может выкидываться встройка? |
Epsilon Новосибирск |
А ПЦР показывает лигирование по обоим сайтам? Вообще, вариантов, при которых у Вас не прошло лигирование, гораздо больше, чем вариантов полного и бесследного удаления встройки в результате её нестабильности. Если можно, опишите подробнее последовательность Ваших действий (ПЦР, рестрикиция, CIAP дефосфорилирование, T4 PNK фосфорилирование, лигирование...). Что конкретно Вы делали? --- К сожалению, причины нестабильности встроек мне известны плохо. Просто я много раз сталкивался с тем, что при клонировании по тупым, либо А/Т концам наблюдается существенная асимметрия направления встройки в клонах, что говорит о селекции против плазмид с одной из ориентаций. Также сталкивался с отсутствием клонов при попытке клонировать встройку в заданной ориентации по разным липким концам. Вероятно, некоторый вклад в возможную нестабильность вносит транскрипция и трансляция встройки, которая имеет место в векторах с репортёрным геном типа серии pUC. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
velekap |
|
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
и я что-то не понял, вы вставку только по ПЦР смотрите? по Eco-Bam ничего не вырезается? и опять таки описание не полное. как вектор чистили после рестрикции? как чистили вставку? |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
velekap |
(ship @ 30.05.2014 18:29) Eco-BamHi режу в Бамовском буфере (кстати в нем режут очень многие ферментасовские рестриктазы), достаточно 2 ч, на ночь не стоит. и я что-то не понял, вы вставку только по ПЦР смотрите? по Eco-Bam ничего не вырезается? и опять таки описание не полное. как вектор чистили после рестрикции? как чистили вставку? Вставку смотрел только по пцр. Поскольку плазмида малокопийная, чтобы увидеть разваливается ли она на две части, это ж надо нарастить много культуры, потом выделить плазмиду - процесс долгий, но я к нему уже подхожу) Для начала вобью её в штамм-ауксотроф по своему гену и там посмотрю по пцр. Возможно, правда, своей долгой рестрикцией я как-то подпортил концы вставки или вектора, хотя эти рестриктазы не значатся звёздными в 2ХTango. Вектор и вставку после рестрикций чистил китом ферментосовским с селикагелем вроде. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
|
Esya Постоянный участник PA, USA |
берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз. Для маленьких добавлю, все хорошо перемешивать и перед инкубациями откручивать. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(Esya @ 02.06.2014 15:06) берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз. спасибо, посмеялся |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
ship Постоянный участник Moscow |
то что вы советуете - это моветон, то как не надо делать. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
знаю я таких пуристов, им все моветон, на банальное клонирование им нужно неделя рабочего времени мне, когда я клонирую, уже ничего в голову не приходит за ненадобностью, в 1001 раз об этом не думают - последний этап думания, когда олиги делаю |
Esya Постоянный участник PA, USA |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(Esya @ 02.06.2014 20:16) а вам в голову не приходит, что вставки дается избыток и она, как правило, длиннее, а, значит, вшивается значительно лучше вставка длинее чего??? мне не приходит в голову. у меня есть опыт, который показывает, что все далеко не так как в книжках и мануалах. у меня ощущение, что вы плазмиды вообще в руках не держали, если уверены в том, что недореза не бывает. и да, неделя уйдет у вас, когда будете разгр*** все то дерьмо, которое вырастет при вашем "способе" клонирования. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
ей богу, мои тапочки уже икают |
velekap |
(R.J.Dio @ 02.06.2014 16:44) то есть без геля? Ну и все, вот вам ответы на все вопросы. Это у вас растет недорез вектора (он есть всегда, не , не так, ВСЕГДА! вне зависимости, видите ли вы его глазками или нет. Только гель! Потому как 100 ретрикций не бывает, есть формы плазмиды, которые не режутся и режутся намного медленнее, конкатамеры всякие, подплавленные одноцепочечные участки, бог ведает что. вам 0,1 % недреза хватит за глаза, прикиньте сами- скажем, 0,1%- это 0,1 нг минимум. С 1 мкг растет 10 в 7. Ну ладно, 10 в 6. Сколько будет фона? Правильно, 10 в 3. Тыща штук. И никогда ничего не заклонируете. Мало плазмиды для вырезания- мужайтесь, копите материю и...режьте из геля Я уже писал, что отбираю клоны на X-gal. Действительно много голубых ,но есть и белые, в которых и моя проблема) |
velekap |
(Esya @ 02.06.2014 18:06) Мальчеги, пардон май френч, вы круче я знаю, а на фига гель для вектора? чем он поможет? Вставку надо после писиара чистить, ибо там мелочь пузатая может лигироваться... берешь гамму плазмиды, режешь ее обоими ферментами (20 ю) 2 часа в 100 мкл, вставку также, концентрация 5-10 раз выше, чистишь колонками. Смешиваешь 1 к 5 и шьешь полчаса на столе. Эффективность процедуры, если фрагменты не очень длинные, 50-95% . Уже много лет как и много раз. Для маленьких добавлю, все хорошо перемешивать и перед инкубациями откручивать. Всё написанное вами было уже обговорено раннее. Всё делалось так, как и у вас - поэтому у меня и возник вопрос, какие могут быть проблемы в такой простой технике. Ничего нового не написали. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
R.J.Dio Постоянный участник |
а) забить на все и всех козлов с советам и продолжать в гордыне б) просто забить и не продолжать в) продумать весь ход работы без гонора и найти ошибку в свете всего вышесказанного ибо она-таки есть, иначе бы все получилось г) окропить стол святой водой и повторить клонирование стати, не уточнялось, фрагмент получен ПЦРом с чего- если с плазмиды с той же устойчивостью, что и целевой вектор, то еще один пойнт- фрагмент также надо чистить на геле (не буду объяснять почему, должно быть понятно) Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 11:24 |
Alex2006 Постоянный участник Берлин |
velekap, а сколько белых колоний Вы проверили? может просто мало? если есть праймеры в векторе и вставке, проверьте колоний 40 через "colony pcr" - и наткнетесь на свою вставку. Быстро и эффективно. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
поэтому, у меня все всегда режется, и у тех, кого я научила тоже, в том числе и в россии (белок из последней российской статьи был проклонирован за 2 дня довольно кривыми руками с использованием мерзкой NdeI) - всегда и шьется - и да, экономить это старье ине не приходится, не знаю, когда само кончится, добавляю по микролитрам повторюсь, проблема не с недорезом вектора, а с недорезом вставки, а недорез вставки из-за - см. выше Сообщение было отредактировано Esya - 03.06.2014 15:24 |
R.J.Dio Постоянный участник |
4 буквы хватает всегда, и Nde я нежно люблю, хоть и ругают его за 2 буквы, которые якобы лигируются хуже, чем тупо, что есть бред, конечно. Изя пусть отдохнет и не полощет мозх молодежи А фраза - проклонировано за 2 дня- ну, во-первых, мы не тараканьих бегах, где 2, там и три, тут точно не принципиально, и потом, 2 дня - это без сиквенса, а без сиквенса клонирование не считается. Так можно посчитать, что вовсе за 2 часа все сделано- типа, порезал- значит, заклонировал, Глупота. Короче, чято там с гелем? А ну так вот- резать надо, а Изя отдохнет Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 15:36 |
velekap |
(Alex2006 @ 03.06.2014 15:02) Лучше всё резать из геля. velekap, а сколько белых колоний Вы проверили? может просто мало? если есть праймеры в векторе и вставке, проверьте колоний 40 через "colony pcr" - и наткнетесь на свою вставку. Быстро и эффективно. Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те. |
velekap |
(R.J.Dio @ 03.06.2014 12:24) если у студиозуса не получается, а новой инфо якобы он не снял, то вариантов тут много можно предложить, а именно : а) забить на все и всех козлов с советам и продолжать в гордыне б) просто забить и не продолжать в) продумать весь ход работы без гонора и найти ошибку в свете всего вышесказанного ибо она-таки есть, иначе бы все получилось г) окропить стол святой водой и повторить клонирование стати, не уточнялось, фрагмент получен ПЦРом с чего- если с плазмиды с той же устойчивостью, что и целевой вектор, то еще один пойнт- фрагмент также надо чистить на геле (не буду объяснять почему, должно быть понятно) ну да, мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск, а потом с новыми силами попытаться опять клонировать) В общем, перезаказал праймеры на вставку, делаю рестрикцию максимум 4 часа, а не ночь, рестрикты чищу не китом. а переосаждаю (после кита почему-то бывали большие потери), концентрации смотрю по форезу и NanoDrop. К концу недели поделюсь результатами. Да, и не студент я)Просто в молбиоле всего чуть больше года и клонирование никогда не делал. |
Esya Постоянный участник PA, USA |
"после кита почему-то бывали большие потери" - спирт в промывочном буфере испарился\выпили " мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск" представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице |
R.J.Dio Постоянный участник |
я? Я не хочу. ни доказывать, что 2х2=4, ничего. У меня-то проблем с клонированием и скоростью ея нету, а имеющий уши да услышит. Воспользуется чел советами- нет, его дело, инфу получил, пусть думает А вы как-то ловко перевели разговор на себя, у вас нету пробем, и еще там чего-то нету (или есть?) , причем тут вы, человек пришел со своим вопросом, а вы все про себя и про себя. точно- америка портит женщин Сообщение было отредактировано R.J.Dio - 03.06.2014 16:28 |
R.J.Dio Постоянный участник |
(velekap @ 03.06.2014 16:48) ну да, мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск, а потом с новыми силами попытаться опять клонировать) В общем, перезаказал праймеры на вставку, делаю рестрикцию максимум 4 часа, а не ночь, рестрикты чищу не китом. а переосаждаю (после кита почему-то бывали большие потери), концентрации смотрю по форезу и NanoDrop. К концу недели поделюсь результатами. Да, и не студент я)Просто в молбиоле всего чуть больше года и клонирование никогда не делал. ну не студент, ок, но начинающий клонировальщик. Это сути не меняет. Попробуйте так и сяк, где получится, там и правильно. |
R.J.Dio Постоянный участник |
(velekap @ 03.06.2014 16:42) Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те. как это М13 отжигаются на хромосоме? Это у вас фоны идут с клеток, грязь, реально пустышка и ПЦР нет. Хотя странно, а почему ж тогда нету короткого ПЦР (фрагмент между двумя М13, полилинкер там и прочая). Что-то у вас в системе напрочь сбоит |
velekap |
(R.J.Dio @ 03.06.2014 17:30) как это М13 отжигаются на хромосоме? Это у вас фоны идут с клеток, грязь, реально пустышка и ПЦР нет. Хотя странно, а почему ж тогда нету короткого ПЦР (фрагмент между двумя М13, полилинкер там и прочая). Что-то у вас в системе напрочь сбоит Чисто с М13 я вижу минимальный фрагмент, вот М13 с праймерами на ген дают неспецифику в пцр с клеток. |
velekap |
(Esya @ 03.06.2014 17:12) R.J.Dio - моя самоуверенность только от опыта, я совершенно спокойно прихожу спрашивать на молбиол и мне помогают - а вы как хотите, мне важнее, что мне не придется траблшутить и я все стандартное делаю с запасом прочности "после кита почему-то бывали большие потери" - спирт в промывочном буфере испарился\выпили " мне уже предложили пока забить, сходить в отпуск" представила американского шефа с таким предложением, скорее, он предложил бы отдохнуть на пособии по безратотице ну с юмором у американцев всё понятно) Тем более, что кроме клонирования достаточно работы, а неудача с ним просто стопорить интересный эксперимент. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
может и на пару дней дольше, но результат гарантирован. вам же не 100 плазмид делать. 1. Берете кит для клонирования тупых продуктов ПЦР (выже наверняка ПЦРите пруфридинг полимеразой?). 2. Клонируете туда свой ПЦР ппродукт. 3. Режете по тем сайтам, что у вас в праймерах, убеждаетесь, что они на месте и вырезается нужная вставка. (не пойму тока почему вам нравится скринировать на вставку ПЦРом, а не рестрикцией) 4. Вырезаете вставку из вектора, чистите из геля. 5. Режете целевой вектор, чистите его из геля. 6. Ставите лигирование и скорее всего через пару дней прыгаете от радости. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
ship Постоянный участник Moscow |
(R.J.Dio @ 03.06.2014 16:23) ну я и имел это ввиду, тока сначала порезать просто, чтобы понять, что сайты на месте, и вставка скорее всего, то что нужно.
|
Alex2006 Постоянный участник Берлин |
(velekap @ 03.06.2014 16:42) Проверил 8 и 4 колоний (2 Тф) - праймерами М13 и перекрестом М13-праймеры на ген. Выяснилось, что с клеток пцр лучше не делать-отжигаются где-то на хромосоме. Пока выделил две плазмиды и их проанализировал. Пока не те. Чисто с М13 я вижу минимальный фрагмент, вот М13 с праймерами на ген дают неспецифику в пцр с клеток. Почему тогда не провести скрининг клонов м13 праймерами? 2,4 даже 8 - это мало. Если количество белых колоний позволяет - проверьте 20-30 м13 праймерами. Только время отжига выставьте на "фрагмент со вставкой", а не на минимальный. |
R.J.Dio Постоянный участник |
|
Alex2006 Постоянный участник Берлин |
есть ощущение, что перескочив щас на субклонирование в левые вектора и на левые пятиминутные протоколы, автор накосячит еще больше |
watchesonline89 Постоянный участник |
|
« Предыдущая тема · Молекулярная и клеточная биология · Следующая тема » |